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论坛上，站友hydwl2019问到：先封闭还是先染死活？
指的是流式样本处理时，死活细胞染色、Fc阻断，哪个先哪个后？
其实DAPI、PI等核酸类死活染料，大家比较容易理解，放在Fc阻断后，上机前.在2010年Cytometry A杂志上，Francois Kuonen等人的文章中提到在小鼠外周血、肿瘤组织染色步骤中，给出了实际例子，采用Fc Block在前（rat anti- mouse CD16/CD32 antibody室温孵育15分钟），再染目标抗体，最后在染DAPI的步骤。
那么对于Live/dead这类胺类染料呢？从一些抗体公司提供的Protocol上来看，Fc Block也是放在最前面的，live/dead染料也是放在前述文献类似的靠后的位置，见：https://www.thermofisher.com/sg/ ... flow-cytometry.html
死活染色、Fc阻断、粘连体排除的重要性
聊到这里，不得不从Francois Kuonen等人的文章进一步深入讲下去。
肿瘤微环境中的髓系细胞在肿瘤发展过程中起着关键作用，包括促进血管生成和肿瘤进展。流式细胞术作为一种强大的技术，可以同时检测多个参数和标记物，在分析肿瘤浸润性髓系细胞亚群方面发挥了重要作用。然而，与分析外周血中的髓系细胞相比，分析肿瘤组织中的髓系细胞需要特别注意一些技术因素，否则可能会导致严重的人为偏差。具体是哪些技术细节呢？就是：
- Fc受体阻断
- 死细胞排除
- 细胞粘连体
Francois Kuonen采用了六色流式细胞术分析从小鼠4T1肿瘤和外周血中分离的CD11b+髓系细胞亚群，使用三种不同的髓系标记物(F4/80、CCR5和Gr1)对CD11b+亚群进行定义。结果证实了死活染色、Fc阻断、粘连体排除对肿瘤组织的结果特别重要：
1、Fc受体阻断对肿瘤浸润性CD11b+细胞亚群的分析非常关键，但对外周血中CD11b+细胞的分析影响较小。未经Fc受体阻断处理的肿瘤样本中，CD11b+亚群的定量和表型分析存在明显偏差。
2、排除死细胞对肿瘤组织中CD11b+细胞亚群的定量分析影响更大，而对外周血样本的影响较小。这可能是由于肿瘤组织中死亡细胞的比例较高，以及它们在CD45-CD11b分布上的差异。
3、排除细胞粘连体对肿瘤浸润性CD11b+细胞亚群的分析也有重要影响，而对外周血样本的影响较小。肿瘤组织中髓系细胞更容易形成细胞粘连体，这可能反映了它们在肿瘤微环境中更强的粘附性。
4、当结合多个标记物(Gr1、F4/80和CCR5)分析CD11b+亚群时，上述技术因素的影响更加明显。未经Fc受体阻断和排除死细胞及粘连体处理，Gr1+F4/80+CCR5+和Gr1+F4/80+CCR5-亚群的相对定量会被严重高估。
因此，作者建议在使用多参数流式细胞术分析肿瘤浸润性CD11b+髓系细胞时，同时应用Fc受体阻断、死亡细胞排除和细胞粘连体排除等步骤，是获得可靠结果的关键技术因素。
参考文献：François, Kuonen., Cédric, Touvrey., Julien, Laurent., Curzio, Rüegg., Curzio, Rüegg. (2010). 9. Fc block treatment, dead cells exclusion, and cell aggregates discrimination concur to prevent phenotypical artifacts in the analysis of subpopulations of tumor‐infiltrating CD11b+ myelomonocytic cells. Cytometry Part A, doi: 10.1002/CYTO.A.20969
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发表于 2024-9-17 22:20:43
发表于 2024-9-18 11:14:29
