多克隆抗体能用作Isotype吗？Isotype的荧光为什么比实验管更强？

niwanmao

本周，两位站友分别在论坛上和公众号上提出了Isotype相关的问题，在此集中回答一下，如各位FLOWER有更多更好的补充，欢迎留言。

多克隆抗体能用作Isotype吗？
WYLLQ站友问道：多克隆抗体能用作isotype control吗？

答：多克隆抗体通常不适合用作同型对照。原因如下：

• 同型对照可通俗的看作是抗体非特异性结合背景，也就是用于确保流式细胞术检测到的信号是针对靶抗原的特异性结合，而不是由于抗体恒定区（Fc区）的非特异性结合或其他背景干扰。同型对照应在物种、同型及荧光素偶联物等方面与实验抗体相匹配，但缺乏对靶抗原的特异性。
  

2. 多克隆抗体是识别同一或不同抗原上多个表位的抗体混合物。这种多样性可能导致与多个非预期靶点的结合，因此不适合作为同型对照使用。

良好同型对照的特征：
- 单克隆抗体，其物种、同型及Fc片段结构应与实验抗体一致。
- 非特异性结合：同型对照不应识别所检测细胞上的任何特异性表位，以准确评估其背景染色。

建议：
- 选择无已知特异性的单克隆抗体作为同型对照。
- 确保同型对照与实验抗体使用完全相同的荧光染料。

因此，如果实验对背景控制要求严格，建议选择一个合适匹配的单克隆抗体，而非多克隆抗体。

Isotype的荧光为什么比实验管更强？
🌲🌳🌴🎄HYL站友问道：您好，我总出现一个问题想咨询一下：单染的活细胞，同型对照管图总是比实验组图更靠右，同型对照管更阳（大约有20%的偏移）。这一般是什么原因呢？抗体是新的，没有失效，先进行了封闭，后进行染色。

「同型对照信号强于实验组」是流式细胞术实验中的一个异常情况。这种情况通常表明实验中存在一些技术性问题或干扰因素。

假设实验步骤无误、仪器状态正常，这种情况常见于：
- 同型对照选择不正确：挑选同型对照首先要选对物种、亚型，如果实验抗体是Mouse IgG1，那么同型对照也必须Mouse IgG1，否则会引起背景不同。
- 抗体浓度问题：仅仅物种和亚型匹配还不够，如果实验组使用的抗体浓度过低，而同型对照抗体浓度较高，也可能导致前述异常现象。此时需仔细检查并调整抗体浓度，确保实验组和对照组使用相同浓度的抗体。
- 非特异性结合：尽管进行了封闭，但同型对照抗体可能仍然存在较强的非特异性结合。可尝试使用不同的封闭剂或增加封闭时间，以减少非特异性结合。（参见论坛2016年的帖子《同型对照荧光比抗体强，咋办？阻断！》https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-5510-1-1.html，出处: 流式中文网）
- 荧光素问题：如果同型对照抗体上的荧光素:抗体比例，比实验组抗体高，可能导致信号偏移。故需检查并确保同型对照结合了相同荧光素且具备相近的荧光素:抗体比例。

此外，样本处理过程中的洗涤步骤、流式细胞仪的设置、荧光素的搭配，均需确保一致。

如果问题仍然存在，考虑更换抗体或咨询抗体供应商。

最后希望大家再去看一下旧帖《再谈同型对照：是该放弃这过时的东西了》https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-5895-1-1.html(出处: 流式中文网)