PMA刺激出现问题

shupian

我们目前的刺激体系是这样的
1. PMA刺激液使用的是 ebioscience eBioscience™ 细胞刺激混合物 (500X)，货号：00-4970-93
2.用10%的1640培养基，1：500，配成混悬液，每孔加200ul
3.刺激时间是5h
4.我们并没有进行计数（受限于实验成本和设备的问题）


现在刺激出现一系列问题，找不到原因
1.刺激后大量的细胞死亡
2.肿瘤细胞量多了之后，刺激不出来
3.感觉抗原表位丢失很多，CD45,CD3经常是染色都很糊

以下是截取的几个代表性的图

有没有老师遇到类似的情况

shupian

这是截取的几个图

niwanmao

shupian 发表于 2024-10-4 19:17
这是截取的几个图

上面CD3/NK1.1的图，有没有事先设门只圈Live/Dead阴性区域？

shupian

niwanmao 发表于 2024-10-5 17:20
上面CD3/NK1.1的图，有没有事先设门只圈Live/Dead阴性区域？

已经是L/D的阴性区域了

niwanmao

shupian 发表于 2024-10-5 22:50
已经是L/D的阴性区域了

Live/Dead阳性区域的，放出来看一下如何？

司徒随风

有尝试调节电压，和增加抗体量吗

天岚

1.此次实验的样本是什么呢？如果是原代细胞，不同提取方法可能造成细胞碎片有差异，会与抗体非特异性结合，导致抗体效价变低，细胞分群不明显。
2.细胞孵育前建议取少量样本检测细胞活率，确定是不是细胞提取的问题。
3.铺板时还是应该计算细胞数量，流式计数或者血细胞计数板人工计数。细胞数量过多也会导致染色后细胞分群不明显。