分泌型蛋白慢病毒包装的滴度检测

zhangpengFACS

大家做慢病毒包装有没有做过分泌型的基因，比如IL2/IL10之类的，在包毒以及最后的流式检测滴度时有什么要注意的吗？

niwanmao

这一块不是很了解

你们是把细胞因子基因通过慢病毒包装到细胞里面，让细胞分泌细胞因子，是吗？

包病毒这一块我没做过，检测的话，我觉得可以同时检测胞内细胞因子和培养上清的游离细胞因子

zhangpengFACS

niwanmao 发表于 2024-10-30 10:04
这一块不是很了解

你们是把细胞因子基因通过慢病毒包装到细胞里面，让细胞分泌细胞因子，是吗？

是的，通过慢病毒编辑细胞因子对应的基因，增强目的细胞的分泌因子的能力；
关于检测的话，首先想到的也是胞内因子检测或者上清检测。
关于滴度检测的话，是用293T生产的病毒感染，有时候会挂荧光标签，然后流式上机检测阳性比例，计算滴度。
但是关于分泌型因子的话，如果没加荧光标签，还不晓得能不能胞内检测，亦或者胞内检测对滴度的阳性比例有没有影响，对后续的病毒转导更是影响，所以问题感觉挺大的，还在探究下

niwanmao

zhangpengFACS 发表于 2024-10-31 09:20
是的，通过慢病毒编辑细胞因子对应的基因，增强目的细胞的分泌因子的能力；
关于检测的话，首先想到的也 ...

如果你们的目的是想让细胞因子分泌出来，那么我觉得检测培养上清中的细胞因子会更好，上清的细胞因子是蛋白质，可通过CBA或Luminex平台检测的

zhangpengFACS

niwanmao 发表于 2024-10-31 10:47
如果你们的目的是想让细胞因子分泌出来，那么我觉得检测培养上清中的细胞因子会更好，上清的细胞因子是蛋 ...

最终目的肯定是让细胞分泌想要的细胞因子，比如最终细胞是T细胞，在这之前需要用293T细胞生产的病毒去重新感染293T细胞，进而根据阳性群体去计算病毒滴度，根据这个滴度再去计算感染T细胞时的用量，通俗点讲就是一个T细胞需要用几个病毒去感染，膜蛋白以前用流式测的话有一个阳性率可以去计算病毒的产量，现在就是缺少一个类似的指标，可以去计算出病毒数，以便对病毒感染T细胞时的体系进行更好的优化~
还是谢谢倪老师的回答，感恩~
上次杭州流式大会很遗憾没有去成，期待下次~特别期待~

一席繁荒

我们用两种方法，第一种是病毒感染293T细胞后用CBA的方法检测上清也中的目标细胞因子分泌情况，计算滴度；第二种方法是病毒感染293T细胞后进行细胞固定破膜进行检测胞内目标细胞因子量；两种方法我们对比，还是固定破膜要好一点，但最好的方法就是病毒结构串联一个可以用流式检测的膜结合的标签最为准确。

zhangpengFACS

一席繁荒 发表于 2024-10-31 16:46
我们用两种方法，第一种是病毒感染293T细胞后用CBA的方法检测上清也中的目标细胞因子分泌情况，计算滴度； ...

收到，谢谢~懂你意思了，再次感谢

Yuck

文献里较多的是加个efgr标签吧，做个二抗

zhangpengFACS

Yuck 发表于 2024-11-1 08:27
文献里较多的是加个efgr标签吧，做个二抗

我在工业界，最终细胞产品还是不太适合随意加标签的

Yuck

zhangpengFACS 发表于 2024-11-1 11:18
我在工业界，最终细胞产品还是不太适合随意加标签的

截断的egfr是允许加的，有广泛临床在用。而且加这个不仅仅是为了检测，也是为了安全着想，可以通过抗抗体定点清除CART细胞。