求助关于 细胞凋亡 调电压 调补偿！！！

wyhwyh

加染液时先加FITC，7min后加PE，7min后加binding终止。
有2个问题：
1、未染FITC也出现双峰，染FITC管出现三峰，是不是因为FITC染色时间过久？
2、单染FITC调补偿时没办法调成平行状态是电压调的有问题还是其他原因？

wyhwyh

未处理组

wyhwyh

补充图片

niwanmao

这个步骤我都没看懂，你是染Annexin V FITC和PI？

zhangpengFACS

正常的BD  凋亡检测试剂盒吗？还是碧云天的呢？或者其他品牌的呢？按照试剂盒操作说明就没什么问题啊

wyhwyh

niwanmao 发表于 2024-11-3 21:26
这个步骤我都没看懂，你是染Annexin V FITC和PI？

是的，染的Annexin V FITC和PI。

步骤是：凋亡和坏死处理（4%多聚甲醛室温孵育细胞30min），处理后细胞分别进行Annexin V FITC单染，PI单染和Annexin V FITC\PI双染。
染色顺序的话是Annexin V FITC染色FITC单染组和双染组，过了 7min PI染色PI单染和双染组，7min 后加Binding buffer冰上终止反应。
为未处理组就是正常细胞未染色，用来调电压

wyhwyh

zhangpengFACS 发表于 2024-11-4 09:06
正常的BD  凋亡检测试剂盒吗？还是碧云天的呢？或者其他品牌的呢？按照试剂盒操作说明就没什么问题啊
...

翌圣的Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒。前几次做没有出现这种情况，只有这次这样，所以想请加一下

niwanmao

wyhwyh 发表于 2024-11-4 18:07
是的，染的Annexin V FITC和PI。

步骤是：凋亡和坏死处理（4%多聚甲醛室温孵育细胞30min），处理后细胞 ...

4％多聚甲醛固定细胞，作为凋亡和坏死处理？这是不是有问题？

另外，染色时，应该是Annexin V染色需要Binding Buffer才能结合，为什么是放在最后用于终止反应？我有点想不通，难道试剂盒告诉你这么做的吗？

wyhwyh

先用100ul binding buffer重悬细胞再加的Annexin V和PI，最后加400ul Binding buffer。
是按照说明书做的

wyhwyh

niwanmao 发表于 2024-11-4 20:54
4％多聚甲醛固定细胞，作为凋亡和坏死处理？这是不是有问题？

另外，染色时，应该是Annexin V染色需要Bi ...

先用100ul binding buffer重悬细胞再加的Annexin V和PI，最后加400ul Binding buffer。
是按照说明书做的