流式分选得细胞，手动计数后发现少了十倍

xyf202220107

你好，我用6只5周左右小鼠制备肺组织单细胞悬液后流式分选出先天淋巴样细胞（ILCs）去细胞培养，用的是BD公司的流式分选仪分选，用5毫升流式管装1毫升20%FBS完全培养基接细胞的(之前也用过纯血清），细胞打到正中央，液面也上升，分选差不多满了就吸到15毫升离心管中(每次大概25分钟），6只老鼠大概分选2个半小时结束，全部分选得细胞是4.4x10^6(机子显示)，可是回来用湘仪离心机1500rpm. 10分钟离心后，手动细胞计数只有5次方（确定已经混匀了），至今不知道什么原因为什么细胞突然从6次方变成5次方。取上清去看，没有细胞，确实被离心下来了，不知道细胞是不是被离碎掉了。问了分选老师，是不是就是分选机子出了问题，老师说没有问题，前面同学用也没出现这样的问题。请问有人出现过这样的问题吗。是怎么解决的呢。万分感谢

niwanmao

4.4x10^6是分选仪上显示的数量吗？

Fusca

感觉一般分选在非单细胞模式下损失读数的20-30%以内都是可以接受的，另外就是亚群越稀有，分选速度越快，这个实际损失值会越大。您的问题可以参看之前的帖子中我的回答：https://flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=viewthread&tid=11092

根据您的描述，机器的分选路径调节没有问题，ILC的尺寸算是比较小的，70um或以上的喷嘴分选应该都没有问题，ILC也不算脆弱细胞，故可以排除1,4,5的问题。您自己也确定了不是离心的问题（如果是离碎了会有很多细胞碎片，这个镜检时应该会看到），那感觉比较可能是drop delay或者圈门的问题。建议楼主有条件的话可以把分选时的圈门和分选仪上显示的细胞数量（sort layout）发一下。看看是不是有圈了冲突的门或者是有用直方图、linear模式圈门到坐标轴以下、没有死活染料圈门等问题。

如果不是圈门的问题，且细胞够用，楼主下次可以取一点点细胞当场回测，看一下分选的准确性。如果发现里面混有较大比例的其他细胞那多半是在此前仪器的分选中已经发生了drop delay的改变但是没有调整，此时实际分选的细胞量和读数可能就会存在很大的差异。大部分平台一天可能drop delay只会做一次，所以这种情况偶尔会发生在一天内有多个连续分选预约后继续分选的情况下。

xyf202220107

niwanmao 发表于 2024-11-22 16:35
4.4x10^6是分选仪上显示的数量吗？

每一个接收管差不多满后看分选仪器显示的数量大概是8x10^5,我接收了5管左右。都是分选仪器显示的数量。我这个细胞比较稀有。

xyf202220107

Fusca 发表于 2024-11-23 20:31
感觉一般分选在非单细胞模式下损失读数的20-30%以内都是可以接受的，另外就是亚群越稀有，分选速度越快，这 ...

好的，非常感谢，明天我又要分选了，我再看看拍一下图片。我之前分选时候，偶尔会发现那个Drop delay 那里的数值老是跳来跳去。