流式分选得的细胞和机子显示差太远，连续好几次都这样

xyf202220107

你好，我用6只5周左右小鼠制备肺组织单细胞悬液后流式分选出先天淋巴样细胞（ILCs）去细胞培养，用的是BD公司的流式分选仪分选，用5毫升流式管装1毫升20%FBS完全培养基接细胞的(之前也用过纯血清）这次上之前也润了一下管子，能看到细胞打到正中央，液面也上升，分选差不多满了就吸到15毫升离心管中(每次大概25分钟），6只老鼠大概分选2个半小时结束，全部分选得细胞加起来是4.4x10^6(机子显示)，可是回来用湘仪离心机1500rpm. 10分钟离心后，手动细胞计数只有5次方（确定已经混匀了），至今不知道什么原因为什么细胞突然从6次方变成5次方。分选回来还没离心之前，也取了计数看，只看到零零星星细胞，离心后取上清去看，没有细胞，确实被离心下来了，不知道细胞是不是被离碎掉了（没有细胞碎片）。问了分选老师，是不是就是分选机子出了问题，老师说没有问题，前面同学用也没出现这样的问题。请问有人出现过这样的问题吗。是怎么解决的呢。万分感谢

niwanmao

分选的问题，需要请马老师@Fusca  帮忙回答一下了

Fusca

感觉圈门应该没有什么问题，按照一些标准操作指南，PerCP Cy5.5 vs APC的那个门不要圈到坐标轴以下更好，但一般不会对结果造成实质性的影响。

但感觉如果你的分选窗口一直维持你照片里的样子，说明振幅是有问题的。如我红圈里圈选所示，在你只分选一群的情况下，你的分选液滴出现了两个，而且大小基本一致，如果一直维持这个状态，你可能有50%的细胞都在电极板加压偏转的这一步中损失了，可能会造成你的细胞损失问题。

这是你的图中的侧液流状态：
D:\Users\user\Desktop\屏幕截图 2024-11-27 185027

这是正常的侧液流状态


可以看到，正常情况下，每一个侧液流点对应一路分选，而你的液流明显出现了分群的现象，如果在分选中一直处于这样的状态，test sort也能看到这个的话，说明电极板结盐比较严重（擦一下电极板）或者是2nd-4rd drop value不是最佳，这个负责分选的老师应该可以处理的。

xyf202220107

好的，谢谢老师

吹散的蒲公英

马老师的解答提到的问题应该是影响结果最主要的问题。
还有一个小问题，对结果影响应该不大：一路及两路分选一般会建议选择双路分选模式，使用15毫升收集管收集；三路及四路分选才建议使用4路分选，使用流式管收集。
还有如果方便的话，下次分选结束后可以把得到的收集细胞上机再看一下，可以看看分选目的细胞的纯度以及大概的细胞量。

Akashi

Fusca 发表于 2024-11-27 21:26
感觉圈门应该没有什么问题，按照一些标准操作指南，PerCP Cy5.5 vs APC的那个门不要圈到坐标轴以下更好，但 ...

您好，我们近期做单路分选时出现test sort正常、但开始分选后液流散开的情况，清理电极板和喷嘴超声均未能改善，请问您知道造成这种情况的可能原因有哪些吗？谢谢！

daileyBEAR

Fusca 发表于 2024-11-27 21:26
感觉圈门应该没有什么问题，按照一些标准操作指南，PerCP Cy5.5 vs APC的那个门不要圈到坐标轴以下更好，但 ...

请教老师一个问题：2路分选时，调节液流是将靠近外边的液流和靠近中间的液流拉在一起、重合为一个液流，还是将靠近外边的液流拉开？
换个问法是最边上voltage slider拉到0还是拉开？

Fusca

daileyBEAR 发表于 2024-12-3 15:57
请教老师一个问题：2路分选时，调节液流是将靠近外边的液流和靠近中间的液流拉在一起、重合为一个液流， ...

如果你只用左一，最左边那个slider应该是0。2路分选的话最边上两路是不用的

Fusca

Akashi 发表于 2024-12-3 15:55
您好，我们近期做单路分选时出现test sort正常、但开始分选后液流散开的情况，清理电极板和喷嘴超声均未能 ...

你可以观察一下是否是一上细胞就液流分散，还是要过一段时间才会这样。
如果是过一段时间才发生这种情况的话，可能和你上样的速度比较快有关，随时间有些液滴不断溅到电极板导致逐步偏转。可以考虑上样速度慢一些。
如果一上机就这样，最常见的解法是先试着调一下2nd drop和3rd drop，让中心液流更聚拢一点（注意test sort时观察的是中心液流是否聚拢为一个很亮的圆斑，而不是看侧液流是不是分叉），因为这两个值不是最佳时会影响中心液流的聚电效应，看看能不能解决。如果还不行可以做一下手动drop delay，看看是否是机器选的drop delay不合适，或者重新调整优化 Ampl 值。再就是考虑换用更大尺寸喷嘴，可能有一些大细胞，如喷嘴直径不够也会出现这个现象。
如果以上都排除，但仍然出现这个现象的话那多半需要工程师来调一下电极板和液流了。

daileyBEAR

Fusca 发表于 2024-12-16 16:47
如果你只用左一，最左边那个slider应该是0。2路分选的话最边上两路是不用的 ...

谢谢老师，我之前操作的时候以为边上的slider拉到0，两个分选口会重合，一直以为要拉开。