流式分选得的细胞和机子显示差太远，连续好几次都这样

xyf202220107

你好，我用6只5周左右小鼠制备肺组织单细胞悬液后流式分选出先天淋巴样细胞（ILCs）去细胞培养，用的是BD公司的流式分选仪分选，用5毫升流式管装1毫升20%FBS完全培养基接细胞的(之前也用过纯血清）这次上之前也润了一下管子，能看到细胞打到正中央，液面也上升，分选差不多满了就吸到15毫升离心管中(每次大概25分钟），6只老鼠大概分选2个半小时结束，全部分选得细胞加起来是4.4x10^6(机子显示)，可是回来用湘仪离心机1500rpm. 10分钟离心后，手动细胞计数只有5次方（确定已经混匀了），至今不知道什么原因为什么细胞突然从6次方变成5次方。分选回来还没离心之前，也取了计数看，只看到零零星星细胞，离心后取上清去看，没有细胞，确实被离心下来了，不知道细胞是不是被离碎掉了（没有细胞碎片）。问了分选老师，是不是就是分选机子出了问题，老师说没有问题，前面同学用也没出现这样的问题。请问有人出现过这样的问题吗。是怎么解决的呢。万分感谢

niwanmao

分选的问题，需要请马老师@Fusca  帮忙回答一下了

Fusca

感觉圈门应该没有什么问题，按照一些标准操作指南，PerCP Cy5.5 vs APC的那个门不要圈到坐标轴以下更好，但一般不会对结果造成实质性的影响。

但感觉如果你的分选窗口一直维持你照片里的样子，说明振幅是有问题的。如我红圈里圈选所示，在你只分选一群的情况下，你的分选液滴出现了两个，而且大小基本一致，如果一直维持这个状态，你可能有50%的细胞都在电极板加压偏转的这一步中损失了，可能会造成你的细胞损失问题。

这是你的图中的侧液流状态：
D:\Users\user\Desktop\屏幕截图 2024-11-27 185027

这是正常的侧液流状态


可以看到，正常情况下，每一个侧液流点对应一路分选，而你的液流明显出现了分群的现象，如果在分选中一直处于这样的状态，test sort也能看到这个的话，说明电极板结盐比较严重（擦一下电极板）或者是2nd-4rd drop value不是最佳，这个负责分选的老师应该可以处理的。

xyf202220107

好的，谢谢老师

吹散的蒲公英

马老师的解答提到的问题应该是影响结果最主要的问题。
还有一个小问题，对结果影响应该不大：一路及两路分选一般会建议选择双路分选模式，使用15毫升收集管收集；三路及四路分选才建议使用4路分选，使用流式管收集。
还有如果方便的话，下次分选结束后可以把得到的收集细胞上机再看一下，可以看看分选目的细胞的纯度以及大概的细胞量。

Akashi

Fusca 发表于 2024-11-27 21:26
感觉圈门应该没有什么问题，按照一些标准操作指南，PerCP Cy5.5 vs APC的那个门不要圈到坐标轴以下更好，但 ...

您好，我们近期做单路分选时出现test sort正常、但开始分选后液流散开的情况，清理电极板和喷嘴超声均未能改善，请问您知道造成这种情况的可能原因有哪些吗？谢谢！

daileyBEAR

Fusca 发表于 2024-11-27 21:26
感觉圈门应该没有什么问题，按照一些标准操作指南，PerCP Cy5.5 vs APC的那个门不要圈到坐标轴以下更好，但 ...

请教老师一个问题：2路分选时，调节液流是将靠近外边的液流和靠近中间的液流拉在一起、重合为一个液流，还是将靠近外边的液流拉开？
换个问法是最边上voltage slider拉到0还是拉开？