即使细胞周期停摆，线粒体DNA依然在增长

niwanmao

线粒体作为细胞内重要的能量工厂，其DNA (mtDNA)的复制与细胞核DNA的复制并不同步。

在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中,即使细胞周期被阻滞,mtDNA仍能继续复制。然而,在细胞周期阻滞状态下mtDNA的复制调控机制尚未完全明了。近期发表在《Frontiers in Cell and Developmental Biology》上的一项研究首次运用流式细胞术,在单细胞水平上观察了细胞周期阻滞时mtDNA的积累变化。这种新颖的流式细胞术方法不仅能定量评估mtDNA的拷贝数,还能分析单个细胞中mtDNA含量的变异性。

研究团队主要采用流式细胞术分析方法。他们使用两种DNA染料:碘化丙啶(PI)和Sytox Green来标记细胞DNA。实验步骤如下:

1、样本准备
- 将酵母细胞固定在70%乙醇中
- 用柠檬酸钠缓冲液(50 mM, pH 7.0)洗涤三次
- 加入RNase A (30 μg/mL)处理2小时
- 加入蛋白酶K处理1小时
- 超声处理分散细胞群

rho+菌株：含有线粒体DNA（mtDNA），rho+菌株在PI和Sytox Green染色后显示出更高的荧光值。

rho0菌株：缺乏线粒体DNA（mtDNA），是去线粒体DNA的突变株。在PI和Sytox Green染色后显示出较低的荧光值。


2、DNA染色
- PI染色:终浓度5 μg/mL
- Sytox Green染色:终浓度0.625 μM
- PI染色样本需4°C孵育至少1小时
- Sytox Green染色样本需4°C孵育30分钟


研究结果：
1、mtDNA含量定量
- 在G2/M期细胞中检测到30.8±6.2拷贝的mtDNA
- 这一结果与之前使用qPCR方法报道的20-40拷贝范围相符

2、细胞周期阻滞对mtDNA积累的影响
- cdc4-3突变株(G1期阻滞)中mtDNA拷贝数增加约3.3倍
- cdc15-2突变株(G2/M期阻滞)中mtDNA拷贝数增加约5.8倍
- qPCR验证显示类似的增幅:cdc4-3增加3.4±1.1倍,cdc15-2增加6.7±3.0倍
- 在rho+和rho0野生型菌株中，高温处理并未改变Sytox Green信号的分布模式，但增加了1n细胞的比例。在cdc4-3和cdc15-2菌株中，细胞周期阻滞导致Sytox Green信号分布模式向右移动，表明总DNA含量增加，rho+细胞比rho0细胞更明显。



3、mtDNA含量与细胞大小的关系
- 在正常生长的细胞中,Sytox Green信号与细胞大小几乎无关
- 细胞周期阻滞后,rho+细胞的DNA含量与细胞大小呈现强相关性
- rho+细胞的回归系数至少是rho0细胞的两倍

4、mtDNA含量的变异性分析
- 尽管细胞周期阻滞导致细胞体积增大,但相同大小细胞间的mtDNA含量变异系数保持稳定
- 这表明即使在细胞周期阻滞状态下,mtDNA的拷贝数仍受到调控


参考文献：Potapenko EY, Kashko ND, Knorre DA. Flow-cytometry reveals mitochondrial DNA accumulation in Saccharomyces cerevisiae cells during cell cycle arrest. Front. Cell Dev. Biol. 2024;12:1497652.