流式染色和荧光电压调节求助

沃兹姬

最近要准备开始流式实验，学习一些知识以后发现还有不少问题不会，可以麻烦各位老师们指点以下问题吗

1.包含有单核/巨噬细胞的样本都需要用Fc blocker？（提取的浸润免疫细胞，但是只测T细胞的话）

2.单染管要加活死吗？然后用同种荧光素的话可以只用一种单染做单染管，有这个荧光素的抗体可以只用这一管调荧光电压和补偿吗（比如CD3 APC，Ccr2 APC，可以只用CD3 APC做单染，然后Ccr2 APC用CD3 APC的单染数据吗）

3.强表达用低亮度的结合荧光素的话会对后面分群造成影响吗（单核细胞CD11b用APC/Cy7 ，Ccr2用APC，这样Ccr2会不会产生假阳性），可以用FMO对照排除这种影响吗

4.如果用到结合荧光素的话，应该给上级标志物用还是下级标志物用好呢（比如CD11b，Ly6c只用PE和PE-Cy7的话，会不会也导致假阳性）

5.活死染料我选择7aad会溢漏到别的通道，但是圈的是7aad阴性群，那么对别的通道影响是不是不大呢？

niwanmao

1.包含有单核/巨噬细胞的样本都需要用Fc blocker？（提取的浸润免疫细胞，但是只测T细胞的话）

答：只要你检测的靶标分群明显，无需Fc Blocking。 如果分群不清的抗原，且干扰因素主要是由非特异性结合引起的，那么无论是单核/巨噬上的还是T、B、NK上的，均需进行Fc Blocking

2.单染管要加活死吗？然后用同种荧光素的话可以只用一种单染做单染管，有这个荧光素的抗体可以只用这一管调荧光电压和补偿吗（比如CD3 APC，Ccr2 APC，可以只用CD3 APC做单染，然后Ccr2 APC用CD3 APC的单染数据吗）

单染管不需要加死活染料，但需要用状态较好且该标记物阳性群分群明显的样本。 像你这里说的APC通道，可以用CD3替代 CCR2， 但如果是串联染料就不行。

3.强表达用低亮度的结合荧光素的话会对后面分群造成影响吗（单核细胞CD11b用APC/Cy7 ，Ccr2用APC，这样Ccr2会不会产生假阳性），可以用FMO对照排除这种影响吗

荧光渗漏，可用FMO对照排除影响

4.如果用到结合荧光素的话，应该给上级标志物用还是下级标志物用好呢（比如CD11b，Ly6c只用PE和PE-Cy7的话，会不会也导致假阳性）

没看懂题目意思，你指的是串联染料？ 另外你这里所说的下级标志物和上级标志物是什么意思？

5.活死染料我选择7aad会溢漏到别的通道，但是圈的是7aad阴性群，那么对别的通道影响是不是不大呢？

这么理解也没错^_^，但你得小心其它通道对7-AAD的渗漏，造成7-AAD假阳性的被你排除掉哦

沃兹姬

niwanmao 发表于 2025-1-5 17:00
1.包含有单核/巨噬细胞的样本都需要用Fc blocker？（提取的浸润免疫细胞，但是只测T细胞的话）

谢谢倪老师的详细解答！关于第4点的问题就是指串联染料，

上下级标志物是指那种A⊆B的标志物，以单核为例，就是CD11b包含在CD45群里，所有CD11b+细胞都表达CD45，CD45就是上级，CD11b就是下级；
然后Ly6c+的细胞都表达CD11b，Ly6c就为CD11b的下级这个意思。（可能也叫子亲代？）

不过这个问题似乎跟第三个相似，主要是担心荧光溢漏问题

niwanmao

沃兹姬 发表于 2025-1-5 23:07
谢谢倪老师的详细解答！关于第4点的问题就是指串联染料，

上下级标志物是指那种A⊆B的标志物，以单核为 ...

流式上通常表达为Parent和Child的关系

串联染料给谁用，目前没有规定，主要还是从抗原表达量、荧光渗漏等角度去考虑的

沃兹姬

niwanmao 发表于 2025-1-6 08:18
流式上通常表达为Parent和Child的关系

串联染料给谁用，目前没有规定，主要还是从抗原表达量、荧光渗漏 ...

倪老师，可以再麻烦您指点一下这样子配色合理嘛，就按照
单核：CD45，CD11b，MHCII-，Ly6c，Ccr2
巨噬细胞：CD45，CD11b，F4/80
这俩圈门策略的话

niwanmao

沃兹姬 发表于 2025-1-15 11:48
倪老师，可以再麻烦您指点一下这样子配色合理嘛，就按照
单核：CD45，CD11b，MHCII-，Ly6c，Ccr2
巨噬细 ...

小鼠的标本我平时不太做，不能帮你确认荧光搭配是否合理

至于抗体这样子问题不大

沃兹姬

niwanmao 发表于 2025-1-15 15:03
小鼠的标本我平时不太做，不能帮你确认荧光搭配是否合理

至于抗体这样子问题不大 ...

明白了，十分感谢倪老师🙏🙏🙏