关于流式加的抗体量计算-超过100w细胞量

xkx330

下周要送流式分选，组织解离的细胞会超过500w，所以在纠结CD45抗体量的计算。
今晚就做了一个很粗糙的对比试验，细胞来源为C57 WT6周龄雄性小鼠的脾（研磨后过40μm滤网制备单细胞悬液），抗体为Biolegend PE-Cy7 anti-mouse CD45(Clone: 30-F11)，流式机为Cytoflex LX。我按照1*10^7/ml的浓度准备了6个样本管（5实验+1空白），每个样本500μl PBS（无BSA/FBS）含有500w脾单细胞（作裂红处理）。

根据说明书的推荐，1.25μl对应100w细胞，按照等比例增加，第一个管加了6.25μl抗体，然后依次减少抗体量，6.25μ减少至5μl、3.75μl、2.5μl、1.25μl，染了活死之后，我发现没啥区别（如下图）
（空白管）
（逐渐稀释后的Live+CD45+圈门）

我的问题如下，希望各位老师给予建议：
1、脾细胞过了40μm滤网貌似基本都是免疫细胞，本次实验是否具有可信度？
2、送分选的组织解离的细胞染色时抗体量计算是否可以参考该次脾细胞的结果？

niwanmao

都是相同电压下获取的吗？

脾脏确实是免疫细胞富集器官，CD45+细胞占比可达95%以上，这个结果应该是合理的。

但是应用到其它组织上，可能包含大量CD45-细胞，组织解离过程可能影响抗体结合位点，建议到时候先取小部分细胞做预实验，并在染色时加入BSA/FBS减少非特异性结合

PS：评价抗体染色性能，其实并不是看其表达百分比，而是计算染色指数(Staining Index)

wxd

从图上看，这个免疫细胞的比例是可信的。
本次实验本质上是个抗体滴定实验，结果也是可信的。楼主的顾虑是说明书推荐的用量比实际需要的用量高很多，这个在几乎所有的流式抗体中都存在，商家的考虑是确保实验成功并且多卖抗体，我们用户考虑的是保证结果的同时尽可能省钱，所以大胆的参考这次的结果即可。

xkx330

niwanmao 发表于 2025-1-8 09:11
都是相同电压下获取的吗？

脾脏确实是免疫细胞富集器官，CD45+细胞占比可达95%以上，这个结果应该是合理的 ...

是相同电压老师，空白管调完电压之后就没动过