FISH结合流式，探索儿童炎症性肠病中的肠道微生物奥秘

niwanmao

炎症性肠病（IBD）是一种影响肠道健康的慢性疾病，其中最常见的主要有克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC）。肠道微生物组的失调被认为是IBD发病的关键因素之一。然而，不同研究在IBD患者肠道中特定细菌群落丰度的变化上存在不一致性。一些研究依赖于宏基因组分析，虽然这种方法具有高度的分辨力，但可能会忽视细菌群落之间的相互关系，这些关系对肠道健康和疾病可能至关重要。此外，细菌的翻译后修饰（PTMs）在原核细胞过程中起着基础性作用，而在微生物组中，可能存在多达240,000种不同的PTMs。酪氨酸磷酸化是细菌中一种特别重要的PTM，尤其在多糖的生产和运输中作用显著。然而，关于炎症如何影响肠道细菌的翻译后修饰（PTM），尤其是酪氨酸磷酸化（p-Tyr），我们知之甚少。

Ulas等人在2024年12月发表的一项研究利用荧光原位杂交-流式细胞术（FISH-FC）技术，对复杂的微生物样本进行高通量分析，而无需复杂的细菌蛋白质组学技术。研究对象包括25名非IBD对照儿童和24名IBD患者（包括13名CD患者、8名UC患者和3名未分类IBD（IBD-U）患者）。所有IBD患者在采样时均被确认有活动性结肠炎症。

在研究IBD儿童肠道微生物组的翻译后修饰（PTM）时，步骤如下：
- 预固定和样本准备：微生物样本首先通过5微米PVDF滤器过滤，以去除较大的非细菌细胞碎片。使用分光光度计对样本进行定量，调整细胞密度至约1×10E10个细胞/mL。样本随后用4%甲醛在1X PBS中固定3小时，以确保细胞结构的完整性。
- 破膜处理：固定后的细胞用50%、80%和95%乙醇依次洗涤，以去除残留的固定剂并增加细胞膜的通透性。随后，细胞在1X PBS中用溶菌酶处理1小时，以进一步增强细胞膜的通透性。
- 杂交：细胞重悬于杂交缓冲液中，加入荧光标记的寡核苷酸探针（与细菌的16S rRNA或23S rRNA特异性结合），浓度为10ng/ul。混合物在50°C下避光孵育过夜，以确保探针与目标RNA充分结合。
- 洗涤：杂交后，细胞用0.1X SSC缓冲液洗涤两次，以去除未结合的探针，确保检测信号的特异性。
- 阻断：沉淀在室温下用1% BSA的PBS溶液孵育1小时，以阻断非特异性结合位点。
- 抗体孵育：用PE偶联的抗磷酸酪氨酸抗体（PY20克隆）或PE小鼠IgG2b,k同种型对照抗体孵育3小时。孵育过程中，细胞避光下轻轻旋转，以减少光照对荧光信号的影响。
- 洗涤：抗体孵育后，细胞用PBS洗涤两次，以去除未结合的抗体。
- 在流式细胞仪上机获取，黄绿光（561纳米）激光用于检测PE偶联PY20抗体信号，红光（640纳米）激光用于检测Cy5偶联FISH探针信号。


研究结果显示，IBD患者的肠道微生物组中p-Tyr信号显著高于非IBD对照组（p = 0.044）。这一发现出乎意料，因为先前的研究表明，宿主产生的过氧化氢（H2O2）会通过降低细菌p-Tyr来减弱微生物的毒力。在IBD的炎症环境中，氧化应激可能导致细菌酪氨酸磷酸酶的失活，从而改变整个微生物组的磷酸酪氨酸稳态。



进一步的分析发现，IBD患者中Bacteroidota、Faecalibacterium prausnitzii、Bifidobacteria和Gammaproteobacteria这四个细菌群落的丰度显著高于非IBD患者（p < 0.001）。特别是Gammaproteobacteria在CD患者中的增加尤为显著。这与先前的研究结果一致，即在炎症条件下，兼性厌氧菌会因氧气条件的改变而扩增。

研究还发现了一个有趣的现象：在非IBD儿童中，9岁以下儿童的肠道微生物组中p-Tyr信号显著高于9岁以上儿童（p = 0.024），而在IBD患者中这一趋势相反，9岁以上患者的p-Tyr信号有上升趋势，但未达到显著性（p = 0.38）。这表明随着儿童的成长，肠道环境会发生动态变化，这种变化在健康儿童和IBD患者中表现不同。


这些发现说明了在解释特定细菌群落丰度差异时，需要考虑年龄、环境位点和技术的差异。此外，肠道微生物组的变化可能不仅仅是特定细菌群落丰度的改变，还可能涉及到更广泛的生理和生化过程。


参考文献：Ulas M, Hussey S, Broderick A, et al. FISH-Flow Cytometry Reveals Microbiome-Wide Changes in Post-Translational Modification and Altered Microbial Abundance Among Children with Inflammatory Bowel Disease. Pathogens. 2024;13(12):1102. Published 2024 Dec 13. doi:10.3390/pathogens13121102