做DNA病毒感染与宿主细胞周期研究时，如何排除病毒基因组的干扰

HuiMinW99

请教大家一个问题，我们通过PI染色来测DNA含量，通过DNA含量来界定宿主细胞处于细胞周期的哪个时期，这种方法适用于研究DNA病毒感染影响宿主细胞的细胞周期吗？我做的是疱疹病毒，这是一种双链DNA病毒，而且这个病毒的基因组很大，约150 kb，如果PI染料可以结合病毒DNA的话，病毒基因组会严重干扰细胞周期分析。有没有什么办法可以区分？

niwanmao

一般一个细胞内会有多少个病毒DNA会整合到宿主DNA中？如果多的话，会严重干扰倍体检测

目前能够想到的可能是：
1、将PI染色与针对宿主细胞特异性周期标志物结合使用（例如，G2/M期使用Cyclin B1，G1期使用Cyclin D1，增殖期使用Ki-67）。这样可以将DNA含量与已知细胞周期蛋白的表达相关联，从而对宿主细胞周期进行更可靠的评估。
2、改用RNA测序或qPCR分析关键细胞周期调节基因（细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶等）的表达水平。这些基因mRNA水平的变化可以让我们在不直接测量DNA含量的情况下了解细胞周期的变化。

HuiMinW99

正好附上今天的实验结果，右边是感染组，左边是未感染组。感染复数是0.05，感染后24h固定制样检测，感染复数已经用很低了，但从PE-Time门来看，感染组那里完全分不出来是病毒基因组的干扰，还是感染后宿主细胞S期细胞增多了

HuiMinW99

niwanmao 发表于 2025-2-22 22:20
一般一个细胞内会有多少个病毒DNA会整合到宿主DNA中？如果多的话，会严重干扰倍体检测

目前能够想到的可能 ...

在下层楼里放了一张图，可以看出感染组2N 4N的界限非常不清晰，这能不能说明病毒基因组对倍体检测的干扰？另外关于解决方案，在实际操作时，是否还能使用70%乙醇进行固定，有说法是乙醇固定可能会使蛋白聚焦，结合位点丢失？

niwanmao

HuiMinW99 发表于 2025-2-23 20:58
在下层楼里放了一张图，可以看出感染组2N 4N的界限非常不清晰，这能不能说明病毒基因组对倍体检测的干扰 ...

乙醇固定绝对没问题，倍体染料结合的是DNA，不是蛋白质

至于病毒基因组是否对倍体检测有干扰，前面说了，理论上多的话会，所以你是否能确定一个细胞大概感染多少病毒？应该是可以监测到的。 其次确认干扰的方法可以用我前面说的加上Ki67或者周期对应的cyclin蛋白，但是核酸染料最好是Hoechst33342