时间分辨流式发现代谢的改变是导致乳腺癌耐药的原因

niwanmao

乳腺癌是全球女性最常见的癌症之一，其中雌激素受体阳性（ER+）亚型约占70%。他莫昔芬作为ER+乳腺癌的标准治疗药物，可通过阻断雌激素信号通路抑制肿瘤生长。然而，约三分之一的患者在长期治疗后出现耐药性，导致疾病复发。近年研究发现，癌细胞的代谢重编程（如糖酵解增强）可能与耐药性相关，但其机制尚未完全明确。美国新墨西哥州立大学团队在《Applied Physics Letters》发表的最新研究中，通过时间分辨流式细胞术（TRFC）揭示了NAD(P)H荧光寿命变化与耐药性的直接关联，为无标记筛选耐药细胞提供了新思路。

TRFC（Time-Resolved Flow Cytometry，时间分辨流式细胞术）是一种结合流式细胞术与荧光寿命分析的高端技术。与传统流式细胞术仅检测荧光强度不同，TRFC通过测量荧光分子从激发态返回基态的平均时间（即荧光寿命），揭示细胞内分子动态结合的细节。其核心公式为：  




代谢标志物NAD(P)H：细胞能量的“指示灯”
NAD(P)H是细胞内关键的辅酶，参与糖酵解和氧化磷酸化（OXPHOS）两大能量代谢途径。其荧光特性随结合状态变化：游离态（糖酵解主导）荧光寿命短（0.3–0.8纳秒），而结合态（OXPHOS主导）寿命较长（1–6.5纳秒）。这一特性使其成为代谢状态的天然生物标志物。研究团队利用TRFC技术，以375 nm激光激发细胞内的NAD(P)H，通过检测相位差计算荧光寿命（公式：τ = tan(Δφ)/(2πF)），实现单细胞水平的高通量代谢分析。

耐药细胞的代谢“转型”：从OXPHOS到糖酵解
为验证代谢转变假说，团队对比了他莫昔芬敏感（MCF-7）与耐药（MCF-7 TamR）细胞：  
1. 共聚焦成像显示，耐药细胞的NAD(P)H荧光强度显著升高，提示游离态比例增加，与糖酵解活跃一致。  


左：MCF-7细胞的共焦显微镜图像。右：MCF-7 TamR细胞的共焦显微镜图像。这些图像的视觉比较显示，在他莫昔芬耐药细胞中NAD(P)H的强度更高。对每种细胞类型的50个细胞进行分析表明，MCF-7 TamR细胞的NAD(P)H原始积分密度高于亲本MCF-7细胞。

2. Seahorse代谢分析进一步量化能量途径：敏感细胞90.4%依赖OXPHOS，而耐药细胞糖酵解贡献提升至33.4%，增幅达3.5倍。  

3. TRFC数据发现关键差异：耐药细胞的平均荧光寿命从5.2纳秒缩短至4.9纳秒（表1），表明代谢向糖酵解偏移。


传统荧光强度检测易受浓度和仪器噪声干扰，而TRFC通过相位分析荧光寿命，避免了这些局限。研究团队优化了系统信噪比（SNR=7-9），并通过荧光微球校准确保数据可靠性。尽管当前的检测通量受限（约200细胞/实验），但TRFC已展示出区分代谢表型的潜力，为未来开发实时分选技术奠定基础。



参考文献：Valentino S, Ortega-Sandoval K, Houston KD, Houston JP. Correlating NAD(P)H lifetime shifts to tamoxifen resistance in breast cancer cells: A metabolic screening study with time-resolved flow cytometry. J Innov Opt Health Sci. 2025 Jan;18(1):2450020. doi: 10.1142/s1793545824500202IF: 2.3 Q2 . PMID: 39980603; PMCID: PMC11841857.