如何对CAR-T细胞进行质检？用CD69活化指数

niwanmao

近年来，CAR-T细胞疗法在血液肿瘤治疗中展现出相当不错的疗效，但其质量控制（QC）仍是行业难题。

传统方法（如细胞杀伤实验或IFNγ检测）因变异性大、操作复杂，难以满足临床级产品的标准化需求。

西班牙巴塞罗那临床医院团队在《Pharmaceutics》发表研究，提出了一种基于流式细胞术的CD69定量检测法，不仅适用于CAR慢病毒载体（LVV）的效力评估，还可直接用于自体CAR-T产品的质检，将检测变异系数降至8.65%。
CD69是T细胞活化的早期标志物，其表达与CAR与抗原结合直接相关，且不受细胞亚群（如CD4/CD8比例）干扰。通过定量流式技术，该方法不仅反映CAR的功能活性，还可同步评估细胞毒性，在单次实验中实现“双指标验证”，大幅提升质检效率。

关键步骤
1、细胞处理与染色  

• 共培养后，细胞用PBS洗涤，300g离心5分钟，重悬。
• 加入抗体（如CD69-APC、CD3-BV421）避光室温孵育15分钟，再次洗涤后上机检测。
• 使用7-AAD评估细胞活性，排除死细胞干扰。
  

2、设门策略与定量校准  

• 通过CD3+设门圈定T细胞群体，分析CD69的平均荧光强度（MFI）。
• 引入MESF微球（Quantum™ APC MESF beads）建立标准曲线，将MFI转换为分子等效可溶性荧光单位（MESF），实现跨实验、跨仪器的定量可比性。
• 计算公式：
  

3、靶细胞选择与共培养优化  

• 使用CD19+的NALM6细胞作为靶细胞，效靶比（E:T）优化为1:5（Jurkat）或1:2（原代T细胞），孵育24小时以平衡信号强度与实验效率。
  

结果
1、CD69的特异性与灵敏度  
- 通过对比CD25、IL-2和CD69的表达，团队发现仅CD69在CAR-Jurkat与靶细胞共培养后显著上调。未转导细胞或无抗原靶细胞（如BCMA−的NALM6）均无响应，特异性达100%。


2、方法学验证结果  
- 精密度：日内变异系数（CV）仅8.65%，日间CV≤20.51%，远低于QC要求的25%。  
- 线性范围：MESF微球标准曲线覆盖4个数量级（994–73,490 MESF），R²>0.999。  
- 准确性：通过不同E:T比验证，回收率稳定在80-120%。

3、跨平台应用潜力  
- 该方法可扩展至靶向BCMA的CAR-LVV，仅需更换靶细胞（如U266骨髓瘤细胞），即实现特异性检测，验证了其作为通用平台的可行性。

4、可用在自体CAR-T产品
- 在10例患者样本中，CD69活化指数与细胞毒性（靶细胞存活率）高度相关。与传统IFNγ检测相比，CD69的变异系数（CV=0.23）显著低于IFNγ（CV=0.81），数据一致性提升3倍以上。

参考文献：Mata-Molanes JJ, Alserawan L, España C, et al. A Quantitative Approach to Potency Testing for Chimeric Antigen Receptor-Encoding Lentiviral Vectors and Autologous CAR-T Cell Products, Using Flow Cytometry. Pharmaceutics. 2025;17(3):303. Published 2025 Feb 25. doi:10.3390/pharmaceutics17030303