人Th2细胞无法用流式检测到胞内因子

面团胖宝宝

细胞来源为人PBMC，美天旎的kit阴性分选出Naïve CD4+T cells后用biolegend的CD3/28磁珠激活，加入20ng/ml IL-4，20ng/ml IL-2, 10ug/ml anti-IFN-gama培养7天后流式检测。

检测流式当天用eBioscience的cellstimulation cocktail激活，同时加入BD的Golgplug和Golgstop,用量均与官网推荐用量一致，5小时后固定破膜上机检测
流式制样先染死活染料Zombie Violet，再封闭FcγR，随后用eBioscience的FOXP3 Fixation/Permeabilization固定破膜（室温，30min）（这一步不知道是不是问题所在？因为我们实验室测胞内因子都用的这个kit，没有另外买专门染胞内因子的kit，但是我测其他细胞的胞内因子用这个FOXP3的kit也没有问题）
然后染CD4，IL-4，IL-5，IL-13, gata3 (室温，1h，不知道这里需要更改为4度过夜孵育？)，最后上机。

以下结果是FMO对照和实验染色组。IL-4和IL-13基本测不到，IL-5能测到一些但是没有分群。Gata3的检测没有问题。qPCR’和ELISA均能检测到IL-4,5,13，所以考虑是流式染色的问题而不是Th2细胞本身的问题。

求老师解答！

niwanmao

整个看下来，感觉eBioscience FOXP3 Fix/Perm Kit可能是需要排查的点吧，破核膜的破膜剂，会不会太剧烈，导致胞浆细胞器定位的因子被漏出去了呢？

面团胖宝宝

老师您好，这是我的流式图结果麻烦您看一下
我打算下次固定换成4%PFA，再不行的话再买BD或者赛默飞的胞内因子固定液试试老师觉得可以吗？

niwanmao

面团胖宝宝 发表于 2025-4-12 03:03
老师您好，这是我的流式图结果麻烦您看一下
我打算下次固定换成4%PFA，再不行的话再买BD或者赛默飞的胞内因 ...

这里的方案都是双色标记吗？

IL-4和IL-13看起来是有出来的，是否可从抗体滴度上面再摸索一下
IL-5似乎是没有，我不知道你们这诱导条件，是否IL-5一定会分泌呢？

面团胖宝宝

标记为FITC-CD4, IL-4-APC, IL-5-APC, IL-13-APC, GATA3-PE, Zombie violet-pacific blue
IL-4, IL-5用的美天旎的抗体，IL-13用的biolegend，抗体浓度均为1:50，对看着是有出来但是和FMO对照比很低，我看有些文献能到20%左右
IL-5通过qpcr和ELISA验证过是分泌的，不知道流式为什么这样。。。

myy559

IC用这个：eBioscience™ 流式胞内固定破膜缓冲液(88-8824-00)；
Foxp3用这个：eBioscience™ Foxp3/转录因子流式固定破膜缓冲液（00-5523-00）。

二者不能混用。

面团胖宝宝

myy559 发表于 2025-4-17 16:55
IC用这个：eBioscience™ 流式胞内固定破膜缓冲液(88-8824-00)；
Foxp3用这个：eBioscience™ Foxp3/转录因 ...

感谢回复！我马上就买新的固定液，组里人太不靠谱了都混用呜呜呜
今天换了4%PFA固定，效果也好了很多~

面团胖宝宝

老师您好，更换了固定液之后感觉结果好了很多，特别是IL-13感觉染的很好
还有个问题就是我做了FMO对照，我圈门应该按着FMO对照圈（图里第二个，但是圈着感觉阳性的圈的太多了？），还是就肉眼圈拖尾出来的阳性部分呢？（图里第三个）
感谢老师解答~

niwanmao

面团胖宝宝 发表于 2025-4-18 00:24
老师您好，更换了固定液之后感觉结果好了很多，特别是IL-13感觉染的很好
还有个问题就是我做了FMO对照，我 ...

这两个做的太漂亮了，固定、破膜的这些细节确实值得大家关注

FMO对照你是不是没有进行固定、破膜？所以导致FMO偏弱一些。建议按照分群位置划分

面团胖宝宝

niwanmao 发表于 2025-4-18 07:03
这两个做的太漂亮了，固定、破膜的这些细节确实值得大家关注

FMO对照你是不是没有进行固定、破膜？所以导 ...

所有细胞都一起进行了固定破膜的。
FMO染的FITC-CD4, Zombie violet-pacific blue
请问老师我需要再做个同型对照：FITC-CD4, Zombie violet-pacific blue, APC-Isotype吗？
不知道什么时候做同型什么时候做FMO，还是都做比较好？
感谢老师解答！