流式间接染色

yundou

用间接标记的流式抗体检测细胞纯度，从镜下看细胞形态符合文献报道，除目的细胞外可能的污染细胞有上皮细胞和单核细胞，但用间接标记抗体进行检测，阳性率不稳定，且分群不明显。一次只进行了间接标记的染色，细胞整体随电压上下移动，分群不明显；一次间接标记分群，阳性比例在20%左右，CD45未染出。两次的实验步骤和抗体用量都是下面的方案。

5乘10的五次方细胞/100μl

1、流式直接染色CD45，FVD死活染色，15分钟，400g洗涤

2、FcR受体封闭10分钟，400g洗涤

3、4%多聚甲醛固定10min，800g洗涤，10分钟

4、90%预冷甲醇破膜15分钟，800g洗涤，10分钟

5、一抗孵育，0.34μg/50μl（说明书稀释浓度），30分钟，800g洗涤两次

6、二抗孵育，30分钟，800g洗涤两次

只有全染没有设置细胞和二抗的组，但之前在其他细胞进行过其他细胞+二抗的设置，基本没有溢出

主要的疑问就是这个阳性率的变化是不同批次间的原因？还是这种间接标记方法本身带来的不稳定？还有就是这个封闭需要洗掉吗，固定会对封闭效果有影响吗，主要是想封闭胞内的非特异性结合？一抗和二抗可以洗一次吗？因为原代细胞细胞数少，可以先用已知表达这个蛋白的细胞系和其他细胞系进行混合进行抗体的检验吗（比如特异性和抗体滴度）？最后这个抗体还可以进行免疫荧光的应用，这种抗体用于间接标记的流式和免疫荧光在特异性上会有区别吗，感觉流式电压对阳性的影响有点大。

niwanmao

用CD45/FSC和CD45/SSC散点图看一下

wxd

阳性率的变化可能是楼主的方法没有做好开发，直接用理论上可行的方法进行检测。实际上方法的很多参数可能都不合适，比如：固定时间、洗涤时离心机转速，一抗和二抗的用量、染色时间及温度。
楼主可以先开展“用已知表达这个蛋白的细胞系和其他细胞系进行混合进行抗体的检验”这个实验，用不同的参数来逼近这个实验的理论值，能接近这个实验理论值的参数才是适合这个实验的。
根据我自己做胞内染色实验的经验，固定后的细胞，洗涤时的离心机转速一般是500g左右离心5 min，弃上清后加破膜液再清洗一次。
另外，胞内染色，可以参考以下这个文章，延长一下一抗和二抗的染色时间。
https://www.flowcyto.cn/bbs/foru ... amp;_dsign=ac721760