“天生杀手”NK细胞也被累垮：CMV慢性刺激如何让免疫卫士陷入疲惫

niwanmao

在人体免疫系统中，NK细胞犹如“天生杀手”，昼夜巡逻，守护健康。NK属于固有免疫，却能像获得性免疫的记忆T细胞一样，对巨细胞病毒（CMV）形成长期记忆。人群中，CMV血清阳性率高达60%–90%。在这些个体的外周血中，常可见一个特殊亚群：CD3⁻CD56dimCD57⁺NKG2C⁺ 的“适应性NK细胞”，其比例可达全部NK细胞的15%以上。这些细胞能够扩增并持续存在，且在再次遭遇CMV时，能迅速分泌大量IFN-γ，展现出典型的记忆特征。



然而，记忆T细胞在长期慢性抗原刺激下会走向“耗竭”，表现为杀伤功能下降、抑制性受体（如PD-1、LAG-3）高表达，以及全基因组DNA甲基化重塑。CMV是一种终身潜伏的慢性感染病毒，这便引出了一个关键问题：适应性NK细胞是否会像T细胞一样，在慢性刺激下走向耗竭？2019年发表于《Journal of Clinical Investigation》的一项研究，系统地回答了这一问题。

实验设计：模拟慢性刺激

为排除肿瘤微环境、免疫抑制药物等混杂因素，研究者采用极简体系进行“单因素”验证：

• 样本选择：选取7名CMV血清阳性健康个体的外周血单个核细胞（PBMC），先用CD3/CD19磁珠耗竭T、B细胞，留下NK细胞与单核细胞的混合体系。
  

- 刺激方式：在24孔板中预包被10 μg/mL的抗体，包括IgG2b同型对照、抗NKG2A/C（克隆131415，可同时结合NKG2A和NKG2C）以及抗NKG2C（克隆134571，仅结合NKG2C）。
- 细胞因子添加：全程加入10 ng/mL IL-15，以模拟CMV感染时体内高水平的IL-15环境。
- 培养周期：在37 °C下培养7天，期间利用CellTrace Violet标记细胞增殖情况。
- 检测方法：通过流式细胞术，在第0天与第7天设门比较细胞的表型与功能变化。


流式细胞术实验

1、抗体组合：CD3-FITC (OKT4)、CD56-APC-Cy7 (HDCD56)、CD57-BV421 (NK-1)、NKG2C-PE (134591)、NKG2A-APC (Z199)、LAG-3-PerCP-Cy5.5 (11C3C65)、PD-1-BV605 (EH12.2H7)、CD45RA-BV510 (HI100)、CD45RO-BV711 (UCHL1)。

2、功能实验
- 在第7天收获NK细胞，以2:1的效靶比与K562髓系白血病细胞共孵育4小时。  
- 前2小时加入GolgiStop + GolgiPlug以阻断分泌，之后破膜（0.05% Triton X-100），进行胞内染色，使用IFN-γ-PE-Cy7 (B27)。  
- 同时，用CD107a-FITC (H4A3)进行表面染色，以评估脱颗粒情况。


结果：慢性刺激使NK细胞“扩增却失灵”
1、扩增：NKG2C⁺NK细胞7天增长3–5倍
- 在抗NKG2C组中，CD57⁺NKG2C⁺细胞比例从基线的15.3%增至45.7%（p=0.007）。  
- CellTrace稀释实验显示，NKG2C⁺群体经历了平均3.3次分裂，远高于对照组的1.1次。

2、表型转换：CD45RA→CD45RO
- 未刺激时，超过95%的NK细胞呈CD45RA⁺CD45RO⁻表型。  
- 经慢性NKG2C刺激后，72%的NKG2C⁺细胞转变为CD45RA⁻CD45RO⁺，且CD45RO的平均荧光强度（MFI）升高4.8倍（p<0.001）。




3、抑制性受体：LAG-3、PD-1“双高”
- 在新鲜血液中，LAG-3、PD-1几乎不表达。  
- 经抗NKG2C培养后，63%的NKG2C⁺细胞表达LAG-3，41%表达PD-1，且有28%的细胞同时表达这两种受体。  
- t-SNE可视化显示LAG-3、PD-1、CD45RO、NKG2C在同一细胞簇中共表达。

4、功能耗竭：IFN-γ分泌量下降60%
- 在抗NKG2C组中，LAG-3⁺NKG2C⁺NK细胞对K562的IFN-γ⁺比例降至13%，而LAG-3⁻NKG2C⁺细胞仍保持32%（p=0.02）。  
- 脱颗粒（CD107a⁺）未显著下降，提示杀伤颗粒释放机制仍在，主要缺陷在于细胞因子分泌。

5、生理刺激验证：CMV感染内皮细胞重现耗竭现象
- 使用TB40/e CMV株感染HUVEC，与CMV阳性供者的NK细胞共培养7天。  
- 与mock对照相比，感染组的NKG2C⁺细胞PD-1表达升高5.1倍，IFN-γ分泌量降低55%。  
- CMV阴性供者的NK细胞则未出现此现象，证实耗竭依赖于既往CMV致敏。

6、全基因组甲基化：与耗竭CD8⁺T细胞“神同步”
- 与IgG对照相比，慢性刺激诱导了3 217个差异甲基化位点（|Δβ|>0.3，FDR<0.05）。  
- 启动子区显著低甲基化：LAG3、PDCD1、TIGIT。  
- 转录因子重编程：FOXO1、FOXP1、SATB1启动子高甲基化（转录抑制），而IKZF3、NFATC2、TOX启动子低甲基化（转录激活），与T细胞耗竭特征基因列表高度重叠。


过去，我们常将PD-1/LAG-3阻断的疗效归功于“唤醒”耗竭的T细胞。然而，现有证据表明，肿瘤微环境中同样存在“耗竭的适应性NK细胞”，它们虽然扩增，却失去了细胞因子分泌能力，且这种耗竭被写入了DNA甲基化图谱。未来，联合靶向T细胞与NK细胞的“双重免疫复苏”策略，或许能让更多患者从免疫检查点抑制剂中获益。毕竟，天生的杀手不应被慢性病毒或肿瘤拖垮，它们值得获得第二次机会。

1. 参考文献：J Clin Invest. 2019;129(9):3770–3785. https://doi.org/10.1172/JCI125916.

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