胞内标记染色讨论

niwanmao

在平时做免疫分型过程中，我们可以感觉得到，胞内标记做起来做复杂，而且最不稳定，你用过哪些胞内染色的标记、固定剂和破膜剂？有什么体会或者高招？来一起讨论一下，凡回帖并言之有物者，会有70％的中奖概率（奖品为3颗流星 ）

我先说说我的体会：
做的最多的是MPO、cyCD79a、cyCD3、cIgM这几个标记。

我刚开始开展免疫分型那段时间，用的是CALTAG的FIX & PERM kit，分为A液和B液，总体还是比较稳定，但是可以明显发现，这些固定之后的细胞，SSC会发生明显减小，各个通道的荧光（不管表面还是胞内）均发生较明显的偏移，因此，如果该标本没有正常内对照（如正常的粒、单、淋等细胞），这时候就得做个同型，以避免发生误判。但总体感觉还不错，按照10分计，可以到7－8分吧。
现在由于医工科招标的缘故，改成了价格更便宜的BD的perm 2（医工科居然没招固定液，晕），由于缺乏了固定成份，所以perm2的偏移更加明显（尤其是胞膜）。

现在尝试着用foxp3 kit中的fix & perm成份（kit中有两个成份，一个是fix & perm，一个是perm成份，根据我做cyclin D1的经验感觉应该前者是固定表面标记＋破细胞膜，后者是破核膜，故采取前者来做胞内标记），做过1次MPO，效果还不错，暂时表面标记如CD45的变化不明显，SSC的变化也还属于可以接受的水平，继续摸索和对照中……

haven_t

几年前用过BD和coulter的，觉得BD的操作繁琐，而且FSC及SSC明显降低。相比之下Coulter的比较好，图形变化不算大，做MPO没问题。但都是很久之前的事了，不知道现在的情况有没有改变。

一成天

我们目前用的就是BD的perm 2，也没有固定的那种，但尚没有感觉散点图明显漂移的情况，
我们主要做胞内的MPO,CD79a，CD3,CD22，做的最多的还是前两个，就是感觉图形有点火箭状，
而且破膜后感觉细胞量损失较多，所以，在破膜前第一次加样本的时候，我都加2倍的标本量

niwanmao

一成天 发表于 2011-11-11 14:57

                               
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我们目前用的就是BD的perm 2，也没有固定的那种，但尚没有感觉散点图明显漂移的情况，
我们主要做胞内的MPO ...

你有没有用自己的固定剂？
我在用perm2的时候感觉CD45 pe-cy7和SSC常常往小的方向偏移，而其它FL1/FL2/FL4三个通道的荧光基本上都向大的数值偏移，你所说的火箭状可能也属于这种偏移吧。

一成天

niwanmao 发表于 2011-11-11 15:35

                               
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你有没有用自己的固定剂？
我在用perm2的时候感觉CD45 pe-cy7和SSC常常往小的方向偏移，而其它FL1/FL2/FL ...

没有用固定剂的，
似有小波动但不明显，除了火箭状。

niwanmao

最近这一个月用foxp3的破膜剂来做胞内标记，条件基本上稳定下来了，效果确实不错，在CD45－SSC图上，所有的细胞群位置基本上跟表面标记时一致。
步骤分享（孵育时均避光，离心均为1500－2000转/分×5分）：
1、加入CD45或其它表面抗体，孵育15 分钟。
2、加入1ml foxp3的fix & perm工作液（1×），孵育15分钟。
3、离心去上清，加入1ml foxp3的perm工作液（1×），洗涤1次，去上清。
4、加入1ml foxp3的perm工作液（1×），孵育20分钟。
5、离心去上清，加入100ul foxp3的perm工作液（1×），并加入胞内抗体，孵育20－30分钟。
6、加入pbs，洗涤一次，上机检测。

rogasan

我这用的跟管理员一样的, 效果不错, 很稳定....

liangyoubao

我们做细胞因子，不同的破膜剂会有不同的结果。

niwanmao

liangyoubao 发表于 2012-1-4 15:47

                               
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我们做细胞因子，不同的破膜剂会有不同的结果。

哦，那是不是因为破膜剂质量问题呢？一般我觉得最好先在其它胞内抗原肯定阳性的细胞上试验该破膜剂效果，肯定质量没问题了，再应用在其它方面。

dragonhzqsmmu

学习了，感觉胞内染色问题很多，细胞丢失和变形很厉害，管理员用的都是BD的试剂？有没有相关的货号？我们用ebioscience的破膜和固定液，感觉效果不是很好