流式Treg检测标准化“作业”：样本保存在几度？最长可保存多久？foxP3要加吗？

niwanmao

提到调节性T细胞 (Treg)，大家一定不陌生。它们就像是免疫系统里的“维和部队” ，负责维持免疫耐受、控制“战火”（过度免疫反应）。

• Treg太少，免疫系统“刹不住车”，就可能导致各种自身免疫病。
• Treg太多，免疫系统“过度纵容”，又可能导致肿瘤“逃逸”。
  

因此，用流式细胞术 (FCM) 精确检测Treg，对于疾病的诊断和治疗至关重要。

然而，理想很丰满，现实很骨感。长期以来，Treg检测一直缺乏统一标准：
- 到底用Foxp3还是CD127？
- 设门 (gating) 策略五花八门 。
- 样本到底能放多久？

别慌！中国医科大学国家临检中心团队一篇2024年发表在《Archives of Pathology & Laboratory Medicine》上的研究，系统性地评估了Treg检测的性能，为临床实验室提供了一份可以直接“抄”的标准化作业！

重点1：选对“组合”—— CD4+CD25+CD127low/- 临床上足够用

还在纠结是否必须做胞内Foxp3吗？

Foxp3虽然是Treg的“身份证”，但检测它需要固定和破膜 (permeabilization)，这套操作不仅复杂、耗时，还容易导致细胞丢失和非特异性染色。更关键的是，很多临床实验室并没有获批的Foxp3试剂 。

解决方案：
研究证实，使用 CD4+CD25+CD127low/- 这个表面标志物组合作为替代策略，是完全可行的！

这项研究通过对比发现， CD4+CD25+CD127low/- Treg的比例 与 CD4+CD25+Foxp3+ Treg的比例 高度相关（r = 0.9198, P < .001） 。

这个策略无需破膜，操作更简单，非常适合在临床使用。


重点2：标准“设门”—— FMO是关键

一个稳定、统一的设门 策略是标准化的第一步。研究团队优化了设门策略：

• 去除粘连体 (doublets) 和碎片： 利用FSC-A vs FSC-H图。
• 圈定淋巴细胞： 利用CD45 vs SSC图（或FSC vs SSC图）。
• 圈定CD4+ T细胞： 在淋巴细胞门中，用CD3 vs CD4图圈出CD3+CD4+群体。
• 定义Treg： 在CD3+CD4+群体中，用CD25 vs CD127图圈出 CD25+ 且 CD127low/- 的细胞。
  

关键提示：
如何准确定义 CD25+ 和 CD127low/- 的界限？ 必须使用FMO（Fluorescence Minus One）对照 来设置门的位置。



重点3：抗体滴定—— 别迷信说明书！

研究发现，三家制造商提供的抗体，其最佳工作浓度差异显著 。

例如，BD试剂的最佳浓度为：CD45 (50 µg/mL), CD3 (6.25 µg/mL), CD4 (1.5 µg/mL), CD25 (6 µg/mL), 和 CD127 (12.5 µg/mL)。

对于Treg检测这类实验室开发的检测项目 (LDT)，每个实验室在正式使用前，都必须自己进行抗体滴定 。建议使用信噪比 (SNR) 来确定最佳浓度。

重点4：黄金72小时—— 样本室温稳定！

采血后，样本能放多久？放冰箱吗？

研究团队测试了健康人、ICU患者和风湿免疫 (RI) 患者的血液样本。

答案来了：
- 室温 (RT) 下，样本可稳定长达72小时！ 在72小时内，所有三家试剂检测Treg的百分比变化均<20%（可接受标准）。
- 96小时后，样本开始“变质”，出现显著不稳定性。
- 是否有必要放4℃？见下图对比，4°C冷藏的样本稳定性并无优势，所以室温即可。




重点5：最低细胞数—— 1000个！

为了结果可信，到底要收集多少个细胞？

研究测试了在 CD3+CD4+ 门内收集10000个到100个不等的细胞数 。

结论是：
CD3+CD4+ 门内的细胞数至少要达到1000个 。

当只收集500个细胞时，BD和Cellgene试剂的变异系数 (CV) 就超标了。虽然QuantoBio在500个时勉强“及格” ，但过少的细胞数会使Treg群体的界定变得困难。



Treg检测标准化“作业”

这项研究为临床实验室提供了一个Treg检测的实用解决方案。下次再做Treg，记住这些关键点：

• 首选方案： CD4+CD25+CD127low/- 表面染色法，结果可靠且与Foxp3高度相关。
• 设门关键： 必须使用FMO对照来准确定位CD25和CD127的门。
• 必做功课： 必须在实验室内对抗体进行滴定，找到最佳SNR浓度。
• 黄金窗口： 样本采血后，室温（RT）下可稳定存放72小时。
• 最低要求： 至少在 CD3+CD4+ 门内收集1000个细胞。
  

1. 参考文献：Liu M, Liu JP, Wang P, et al. Approaches for Performance Verification Toward Standardization of Peripheral Blood Regulatory T-Cell Detection by Flow Cytometry. Arch Pathol Lab Med. 2024;148(11):1234-1243. doi:10.5858/arpa.2023-0284-OA

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毛豆24821

室温 (RT) 下，样本可稳定长达72小时！ 在72小时内，所有三家试剂检测Treg的百分比变化均<20%（可接受标准）。
这点存疑，您经验里有啥样本处理和染色方式比较稳定吗？

niwanmao

毛豆24821 发表于 2025-11-11 17:05
室温 (RT) 下，样本可稳定长达72小时！ 在72小时内，所有三家试剂检测Treg的百分比变化均 ...

这是计算Treg占CD4+T细胞的比例，不是绝对数，因为T细胞比中性粒细胞不容易凋亡，所以这个比例稳定我认为是有可能的