foxp3破膜剂用于胞内标记染色的尝试

niwanmao

最近这段时间，因为BD的Perm2内似乎不含固定剂，对细胞形态、表面标记的荧光影响很大，于是我就尝试用biolegend的foxp3破膜剂kit代替，测试了几次，发现如下情况：
1、该kit包含了fix&perm和perm两个组分，刚开始我猜测fix&perm组分是用于固定表面标记并破胞膜，perm用于破核膜，于是就只动用了第一个组分，结果，发现胞内的标记根本染不上（例如染MPO时，正常的粒细胞那群居然都是阴性的）。
2、基于光用fix&perm这一个组分不行，我就把perm组分也用上，只是步骤简化了一些，发现效果出来了，不光细胞形态和单纯的表面染色时差不多，而且阳性、阴性分的很清楚，感觉比那时候使用caltag的fix&perm效果还要好，不知道这里面用的是什么成份。
兴奋之余，跟大家分享一下简单的步骤：
1、表面染色
2、加入1ml 1×fix&perm，孵育15分钟。
3、PBS洗涤1次。
4、加入100ul 1×Perm，同时加入胞内抗体，一起孵育30分钟。
5、PBS洗涤1次。
6、上机。

niwanmao

切记：FOXP3的破膜剂可用于胞内的标记染色，反之，CALTAG（现已被invitrogen收购）的fix & Perm、BD的Perm2不能用于FOXP3、cyclin D1的染色，因为这两个标记是核内的，这些破膜剂都只能破胞膜，没法破核膜。

chujindong

niwanmao 发表于 2011-11-22 09:21

                               
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切记：FOXP3的破膜剂可用于胞内的标记染色，反之，CALTAG（现已被invitrogen收购）的fix & Perm、BD的Perm2 ...

最近做treg，发现破核膜剂少了。我用的是BD的，于是想继续买BD的kit，但实在是太慢了，要等一个月。看倪老师经验的话应该就可以用biolegend的代替了。

niwanmao

chujindong 发表于 2011-11-22 18:45

                               
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最近做treg，发现破核膜剂少了。我用的是BD的，于是想继续买BD的kit，但实在是太慢了，要等一个月。看倪 ...

当然可以。我用它做过cyclin D1，效果还不错。

chujindong

看步骤很省时间啊，比BD的快了至少半小时啊。倪老师精简了一下啊。

niwanmao

chujindong 发表于 2011-11-22 18:56

                               
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看步骤很省时间啊，比BD的快了至少半小时啊。倪老师精简了一下啊。

这个步骤是用于胞内标记，不是用于核内标记。

核内标记我还是按照原来说明书上的步骤，即第4步开始，先用1×perm洗涤一次，然后1ml 1×perm孵育15分钟，离心去上清，最后再用100ul 1×perm＋抗体孵育30分钟。所以核内的步骤还是一样很费时间的。

chujindong

niwanmao 发表于 2011-11-22 19:14

                               
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这个步骤是用于胞内标记，不是用于核内标记。

核内标记我还是按照原来说明书上的步骤，即第4步开始，先 ...

原来是这样。刚刚还很兴奋呢，看了说明书发现不一样。倪老师平时做的时候有没有减试剂的量试试呢？我觉得2ml跟1ml似乎不会有什么区别。

niwanmao

chujindong 发表于 2011-11-22 19:20

                               
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原来是这样。刚刚还很兴奋呢，看了说明书发现不一样。倪老师平时做的时候有没有减试剂的量试试呢？我觉得 ...

这个核破膜剂说明书上就是1ml。我没减量。一般说，应该影响不大的。

alina1123

倪老师，foxp3破膜剂有4X的还有10X的，这个两个有没有区别？你用的是哪一款呢？

niwanmao

alina1123 发表于 2012-6-26 09:29

                               
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倪老师，foxp3破膜剂有4X的还有10X的，这个两个有没有区别？你用的是哪一款呢？ ...

你是不是指两个组分，那都要用的。只要稀释到1×的工作液就行了。
我在用的是biolegend的foxP3破膜剂，4×是fix&Perm组分，主要用来固定表面标记，10×是Perm组分，用来破膜，相信其它公司的应该也可以。