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foxp3破膜剂用于胞内标记染色的尝试

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发表于 2011-11-21 09:57:20 | 显示全部楼层 |阅读模式

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最近这段时间,因为BD的Perm2内似乎不含固定剂,对细胞形态、表面标记的荧光影响很大,于是我就尝试用biolegend的foxp3破膜剂kit代替,测试了几次,发现如下情况:
1、该kit包含了fix&perm和perm两个组分,刚开始我猜测fix&perm组分是用于固定表面标记并破胞膜,perm用于破核膜,于是就只动用了第一个组分,结果,发现胞内的标记根本染不上(例如染MPO时,正常的粒细胞那群居然都是阴性的)。
2、基于光用fix&perm这一个组分不行,我就把perm组分也用上,只是步骤简化了一些,发现效果出来了,不光细胞形态和单纯的表面染色时差不多,而且阳性、阴性分的很清楚,感觉比那时候使用caltag的fix&perm效果还要好,不知道这里面用的是什么成份。
兴奋之余,跟大家分享一下简单的步骤:
1、表面染色
2、加入1ml 1×fix&perm,孵育15分钟。
3、PBS洗涤1次。
4、加入100ul 1×Perm,同时加入胞内抗体,一起孵育30分钟。
5、PBS洗涤1次。
6、上机。
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 楼主| 发表于 2011-11-22 09:21:54 | 显示全部楼层
切记:FOXP3的破膜剂可用于胞内的标记染色,反之,CALTAG(现已被invitrogen收购)的fix & Perm、BD的Perm2不能用于FOXP3、cyclin D1的染色,因为这两个标记是核内的,这些破膜剂都只能破胞膜,没法破核膜。
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发表于 2011-11-22 18:45:57 | 显示全部楼层
本帖最后由 chujindong 于 2011-11-22 18:48 编辑


最近做treg,发现破核膜剂少了。我用的是BD的,于是想继续买BD的kit,但实在是太慢了,要等一个月。看倪老师经验的话应该就可以用biolegend的代替了。
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 楼主| 发表于 2011-11-22 18:51:10 | 显示全部楼层
chujindong 发表于 2011-11-22 18:45
最近做treg,发现破核膜剂少了。我用的是BD的,于是想继续买BD的kit,但实在是太慢了,要等一个月。看倪 ...

当然可以。我用它做过cyclin D1,效果还不错。
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发表于 2011-11-22 18:56:55 | 显示全部楼层
本帖最后由 chujindong 于 2011-11-22 19:07 编辑

看步骤很省时间啊,比BD的快了至少半小时啊。倪老师精简了一下啊。
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 楼主| 发表于 2011-11-22 19:14:04 | 显示全部楼层
chujindong 发表于 2011-11-22 18:56
看步骤很省时间啊,比BD的快了至少半小时啊。倪老师精简了一下啊。

这个步骤是用于胞内标记,不是用于核内标记。

核内标记我还是按照原来说明书上的步骤,即第4步开始,先用1×perm洗涤一次,然后1ml 1×perm孵育15分钟,离心去上清,最后再用100ul 1×perm+抗体孵育30分钟。所以核内的步骤还是一样很费时间的。
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发表于 2011-11-22 19:20:21 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2011-11-22 19:14
这个步骤是用于胞内标记,不是用于核内标记。

核内标记我还是按照原来说明书上的步骤,即第4步开始,先 ...

原来是这样。刚刚还很兴奋呢,看了说明书发现不一样。倪老师平时做的时候有没有减试剂的量试试呢?我觉得2ml跟1ml似乎不会有什么区别。
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 楼主| 发表于 2011-11-22 19:45:33 | 显示全部楼层
chujindong 发表于 2011-11-22 19:20
原来是这样。刚刚还很兴奋呢,看了说明书发现不一样。倪老师平时做的时候有没有减试剂的量试试呢?我觉得 ...

这个核破膜剂说明书上就是1ml。我没减量。一般说,应该影响不大的。
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发表于 2012-6-26 09:29:33 | 显示全部楼层
倪老师,foxp3破膜剂有4X的还有10X的,这个两个有没有区别?你用的是哪一款呢?
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 楼主| 发表于 2012-6-26 10:49:57 | 显示全部楼层
alina1123 发表于 2012-6-26 09:29
倪老师,foxp3破膜剂有4X的还有10X的,这个两个有没有区别?你用的是哪一款呢? ...

你是不是指两个组分,那都要用的。只要稀释到1×的工作液就行了。
我在用的是biolegend的foxP3破膜剂,4×是fix&Perm组分,主要用来固定表面标记,10×是Perm组分,用来破膜,相信其它公司的应该也可以。
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