凋亡操作失败

程薇

最近用BD 凋亡试剂盒做了几次培养的小鼠的细胞，结果很不理想，不知谁有没有详细的操作流程，谢谢

niwanmao

我们这边的研究生用这个试剂盒做出的结果很不错啊，虽然跟你做的细胞种类不同，但这应该不是问题关键。染色的步骤很简单，这更加不是问题，BUFFER洗涤1－2次之后，看细胞数量加入500ul的BUFFER重悬，然后按照说明书加入AV和PI即可。

不知道能否上传几张图片看看，或许可以看出是细胞问题还是试剂问题。

程薇

现在手上没有图片，前几次做时FSC/SSC图取线性，细胞可以看到很集中的一团，但只有死细胞没有凋亡细胞；昨天做时必须用对数才行，而且没有PI阳性，不知道怎么回事？

niwanmao

程薇 发表于 2011-11-26 11:05

                               
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现在手上没有图片，前几次做时FSC/SSC图取线性，细胞可以看到很集中的一团，但只有死细胞没有凋亡细胞；昨 ...

1、“FSC/SSC图取线性，细胞可以看到很集中的一团，但只有死细胞没有凋亡细胞”－－－》你是指只有PI阳性，而AV全部都是阴性？？？

2、“昨天做时必须用对数才行，而且没有PI阳性”－－－》用对数的时候就得小心有可能只是调出一些杂质信号，而非正常的细胞。


建议你每次上机前可以先用显微镜观察一下细胞形态，或者用台盼蓝拒染观察一下细胞活力，然后再做AVPI就有数一点。

shen_coco

关注中，以后也准备做凋亡了

兔子赵

把细胞数控制一下试试  0.5X5次方
我之前遇到过这样  后来有人跟我说可能是浓度太大

兔子赵

niwanmao 发表于 2011-11-26 10:59

                               
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我们这边的研究生用这个试剂盒做出的结果很不错啊，虽然跟你做的细胞种类不同，但这应该不是问题关键。染色 ...

BD为了效果一般式要求先加100ULBUFFER,染色孵育后上机前补400

niwanmao

兔子赵 发表于 2011-11-28 14:26

                               
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把细胞数控制一下试试  0.5X5次方
我之前遇到过这样  后来有人跟我说可能是浓度太大
...

如果是细胞数的问题的话，我觉得也不至于一点AV+的细胞都没有。如果能排除染色的时候漏加AV的话，我总觉得楼主的问题应该出现在获取上。

jingweis530

要用含有Ca离子缓冲液悬浮细胞并孵育染色。

niwanmao

jingweis530 发表于 2011-11-29 08:35

                               
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要用含有Ca离子缓冲液悬浮细胞并孵育染色。

对，缓冲液的问题也需要考虑。