请老师帮忙分析我的两次凋亡检测结果

vetzcm · 发表于 2011-12-10 17:37:25

大家好！
最近我用流式检测药物致HepG2细胞凋亡的情况，（结果见附近）使用方法是AV+PI法，两次结果都很怪异，请大家帮忙分析下原因，问题较多，谢谢大家的耐心回答！
一，文件名标有20111201是同一批结果：
问题1：请老师帮忙看一下，流式检测时P1和P2门设置正确吗？
问题2：在计算细胞凋亡率时，是不是Q2+Q4的总和作为细胞凋亡率，或者可以用P2门中的结果作为细胞凋亡率呢？
问题3：这是第一次做凋亡，没有设置阳性单染的对照，很晕的做了空白AV、PI单染的孔，分别是“空白未处理细胞 AV单染20111201和空白未处理细胞 PI单染20111201”，从结果中看，空白未给药的HepG2细胞，单染后，好多阳性的细胞啊，这也太不正常了，使自己处理细胞的问题吗？或者有其他原因？
问题4：给药组药物浓度分别为200,400,800，从结果看，凋亡率依次为20.3%，21.9%，22.8%（Q2+Q4），因为本批实验没做空白AV+PI双染，但从“空白未处理细胞 AV单染20111201”看出，空白的细胞凋亡率应该至少28.7%左右（Q4），这样分析，我给的药不但不促进细胞凋亡，还比空白细胞凋亡率低......这和MTT实验和显微镜下所见不一致啊！！！
二，文件名标有20111209的是第二次流式结果
本次做了空白为处理细胞AV+PI双染，阳性AV，PI单染的，200,400,800给药组
问题5：本次结果，是调节荧光补偿差不多PE-95%FITC后所得的结果，这个荧光补偿也太大了啊！是不是机器荧光通道有问题了呢？
问题6：分析本次结果，空白未处理细胞，200,400,800组细胞的凋亡率依次为：24.8%，17.8%，15.9%，24.1% ，多么诡异的结果啊，没给药处理组的细胞凋亡率竟然还是奇迹般地比给药处理组高！

空白未处理细胞 AV PI2011209.pdf (20.05 KB, 下载次数: 56)

药物800 AV PI20111209.pdf (20.51 KB, 下载次数: 42)

药物400 AV PI20111209.pdf (19.18 KB, 下载次数: 15)

药物200 AV PI20111209.pdf (19.21 KB, 下载次数: 15)

阳性 PI单染20111209.pdf (17.59 KB, 下载次数: 28)

阳性 AV单染20111209.pdf (18.3 KB, 下载次数: 26)

药物800 AV PI20111201.pdf (18.75 KB, 下载次数: 14)

药物400 AV PI20111201.pdf (18.48 KB, 下载次数: 12)

药物200 AV PI20111201.pdf (18.66 KB, 下载次数: 14)

空白未处理细胞 PI单染20111201.pdf (17.23 KB, 下载次数: 18)

空白未处理细胞 AV单染20112001.pdf (17.97 KB, 下载次数: 20)

空白未处理细胞20111201.pdf (15.54 KB, 下载次数: 16)

niwanmao · 发表于 2011-12-10 17:37:26

1、门的设置没有原则性问题。
2、计算凋亡最好只使用Q4。
3、4、5、你所谓的空白确定没有加过任何可能诱导细胞凋亡的药物？或者你确定没有跟其它处理孔的标本混起来？建议你再重复几次。其它几个浓度差异不大，多做几次我觉得应该统计学差异不大。

vetzcm · 发表于 2011-12-11 12:06:56

niwanmao 发表于 2011-12-10 21:17

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1、门的设置没有原则性问题。
2、计算凋亡最好只使用Q4。
3、4、5、你所谓的空白确定没有加过任何可能诱导 ...

谢谢倪老师的解惑！
1，我做的HepG2细胞比较难消化成单细胞悬液，会有细胞结团，虽然上机前用400目纱网过滤（好像太密了，200目或300目应该好些吧，不知道会不会弄碎细胞啊），但可能细胞液中还是会有2-3个细胞结成的团块存在，所以，是不是在设门获取数据时是不是要舍弃哪些FSC,SSC值偏大的细胞，将门局限于细胞集群的地方更好些呢？
2，如果用Q2+Q4计算凋亡是不是也可以呢？
3,4,5空白组确实是没加任何药物，就是常规的细胞培养，在处理时也没跟其他标本混淆，因为我们实验室有流式细胞仪，都是处理好样品直接上机的，这一点我试验中重视了。我会再重复下试验的。唉！要是真是诱导凋亡不明显，我想这药物就不好做实验啦....

niwanmao · 发表于 2011-12-11 15:08:42

vetzcm 发表于 2011-12-11 12:06

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谢谢倪老师的解惑！
1，我做的HepG2细胞比较难消化成单细胞悬液，会有细胞结团，虽然上机前用400目纱网过 ...

1、HepG2是贴壁细胞，可以消化，也可以使用细胞刮匙把细胞刮下来。建议你可以试试。
2、Q2＋Q4就怕你到时候发文章时有些审稿的编辑不承认，因为Q2也可能是坏死的细胞。
3、空白组如果确实没问题，这我就实在也想不通了，呵呵。只能重复几次再看了。在每次上机前都注意观察一下各自的形态。

stef1981 · 发表于 2011-12-11 16:02:16

空白和低浓度的凋亡都很高，说明细胞处理有问题，操作上对细胞损伤太大了
我们做的大部分癌细胞、贴壁培养细胞实验凋亡都出现在Q2，只有悬浮培养细胞、淋巴细胞等小细胞才会出现在Q4，细胞消化对细胞表面会有损伤，无法避免

vetzcm · 发表于 2011-12-11 20:14:01

niwanmao 发表于 2011-12-11 15:08

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1、HepG2是贴壁细胞，可以消化，也可以使用细胞刮匙把细胞刮下来。建议你可以试试。
2、Q2＋Q4就怕你到时 ...

嗯，谢谢老师的意见！看来是要多做做看啦！

vetzcm · 发表于 2011-12-11 20:18:03

stef1981 发表于 2011-12-11 16:02

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空白和低浓度的凋亡都很高，说明细胞处理有问题，操作上对细胞损伤太大了
我们做的大部分癌细胞、贴壁培养 ...

请问您对于做癌症细胞的凋亡，在前处理阶段有什么好的建议吗？从结果看，Q2出现的确实挺多的，而且HepG2细胞体积确实小，正常情况下还有堆积生长的特点，是不是这个细胞的生长特性决定了，空白的细胞自然情况下凋亡率就很高呢？那不用流式检测，改用其他检测方法是不是好些呢？

niwanmao · 发表于 2011-12-11 20:35:53

vetzcm 发表于 2011-12-11 20:18
请问您对于做癌症细胞的凋亡，在前处理阶段有什么好的建议吗？从结果看，Q2出现的确实挺多的，而且HepG2 ...

贴壁细胞可以试试tunel

stef1981 · 发表于 2011-12-12 08:56:11

vetzcm 发表于 2011-12-11 20:18

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请问您对于做癌症细胞的凋亡，在前处理阶段有什么好的建议吗？从结果看，Q2出现的确实挺多的，而且HepG2 ...

就常规的处理方法，0.25%的胰酶消化，显微镜下观察形态，不要消化过了，多吹几下，不过纱网，洗一次，加染料

vetzcm · 发表于 2011-12-12 22:02:28

niwanmao 发表于 2011-12-11 20:35

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贴壁细胞可以试试tunel

谢谢老师的建议！

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