细胞固定问题

yuchuan

做流式我是一个新手，我想请教一下大家，用间接法检测膜上蛋白检，在孵育一抗前我用4%多聚甲醛固定细胞，然后PBS洗三次，最后流式能检测到，而我不固定细胞直接做，直接检测，却是阴性结果，这是什么原因？多聚甲醛固定细胞可以透膜吗？但是我并没有用穿孔剂穿孔！有的用乙醇固定，究竟是什么作用？有什么区别？做流式都用哪几种固定剂？固定与不固定有什么区别？谢谢大家

niwanmao

关于多聚甲醛的使用问题，之前有过讨论：http://www.flowcyto.cn/forum.php?mod=viewthread&tid=1134

1、至于你提到的固定与不固定之间的结果差异，请明确一下是否两次都做了同型对照？一般来说固定之后细胞形态发生了改变，会导致荧光偏移，所以必须要有同型对照用同样的处理方式做对照。

2、流式常用的固定剂就是多聚甲醛，至于乙醇，那种固定之后细胞膜表面位点容易受到破坏，一般只用于DNA倍体检测。

yuchuan

谢谢你的回答，我的阴性对照是只加FITC标记的二抗没加一抗作为对照。如图，而不固定的结果和阴性结果没什么区别，固定后变化很大，者是什么原因呢？现在一直闹不明白，急求您的帮助

yuchuan

以下是不固定结果

niwanmao

yuchuan 发表于 2011-12-15 16:00

                               
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谢谢你的回答，我的阴性对照是只加FITC标记的二抗没加一抗作为对照。如图，而不固定的结果和阴性结果没什么 ...

这两张图片怎么图片名称和说明不一致？我没看懂什么意思，两张图片都是固定过的标本做的？
你所谓的阴性对照是不正确的，阴性对照是指使用表达该标记肯定是阴性的细胞。按照你的描述，这个最多只能算做空白对照，因为没有一抗的话，二抗几乎是不结合上的，因为物种不一样。

固定和不固定的背景强度肯定会有改变，所以我建议你设置一个同型对照，即买一个跟一抗相同来源、IgG亚型相同的同型对照抗体（可以看你的抗体说明书，例如你的一抗的免疫球蛋白是鼠IgG1来源的，那么就需要购买鼠IgG1作为同型对照），这个同型对照抗体处理步骤跟一抗一样，到时候二抗也要加，这样才能体现结合的背景。根据这个背景，才能准确的划分出阴性、阳性界限。

yuchuan

谢谢您的回答，这两个名称是颠倒了，都是固定过的。根据您的建议是不是我的一抗是鼠源IgG1，那么我找其他一株已经鉴定好的为鼠抗鸡抗体，其亚型也是IgG1就可以。会不会出现加入同型对照后就明显有同实验结果中那样的阳性反应？现在好是担心

niwanmao

yuchuan 发表于 2011-12-17 10:48

                               
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谢谢您的回答，这两个名称是颠倒了，都是固定过的。根据您的建议是不是我的一抗是鼠源IgG1，那么我找其他一 ...

举个例子：
假如你的一抗是鼠抗鸡CD3，看它的说明书它的亚型是IgG1型的。那么你选择的同型对照就是鼠抗鸡的IgG1，这样的同型才能体现CD3结合时的背景。
这个同型对照的IgG1和CD3处理的步骤是一样的。

大概就是这么一个道理。

yuchuan

哦，好的谢谢您。我这就着手重新做一次