FCAS检测活细胞内的ROS

民间恺撒 · 发表于 2011-12-24 14:48:57

老师，您好。这是我昨天做的流式图，机子的型号是BD的Calibur。
总共有6组，阴性对照组：PC-12细胞，正常组：PC-12细胞+DCFH探针，损伤组

C-12细胞+Aβ+DCFH探针，药物治疗组：PC-12细胞+Aβ+AP（是我做的药物）+DCFH探针，阳性对照组：H2O2+DCFH探针，单纯的药物组：PC-12细胞+DCFH探针。DCFH的终浓度大致为10UM。后面加20000的是检测了20000个细胞的，没加的是检测10000个细胞的。
  注：因为我培养细胞的地方离有流式机子的地方大致有1个小时的路程，因此我是先等药物处理时间到了后把培养基换成无血清的，后加入探针，避光处理30min，每5min晃动下。后吸出上清，PBS洗一遍后再换成无血清的培养基。放到冰盒里，拿到实验室去检测（这期间大概有1h）。后吸出上清，PBS洗3遍，消化，离心3次，再上机检测。
  我想问的问题是：1.在这过程中以结合探针的细胞会不会凋亡，那ROS改变的多不多？
               2.因为我的药物加进去后也有点荧光强度的，那我分析药物的治疗作用可不可以用药物治疗组的平均荧光强度（MFI）——单纯的药物组的MFI后再于损伤组的MFI进行对比。谢谢。

20000个细胞.rar (716.62 KB, 下载次数: 46)

10000个细胞.rar (938.11 KB, 下载次数: 18)

niwanmao · 发表于 2011-12-24 14:48:58

这玩意儿我还真没做过，可以请stef1981战友回答一下。
按照我对这个原理的理解，我觉得这一个小时的凋亡水平对于结果的影响是应该可以忽略不计的，至于药物的影响，只要你的药物发射波长不在绿色荧光通道就没事。

stef1981 · 发表于 2011-12-25 11:45:23

短时间内细胞不会凋亡，1个小时变化不大，ROS也影响不大
荧光强度不能靠相减来抵消，你的药物带什么颜色的荧光？看你单纯的药物组荧光变化还是比较大

民间恺撒 · 发表于 2011-12-25 12:47:40

stef1981 发表于 2011-12-25 11:45

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短时间内细胞不会凋亡，1个小时变化不大，ROS也影响不大
荧光强度不能靠相减来抵消，你的药物带什么颜色的 ...

  我的药物AP是孕激素的一个代谢产物，还真不知道是带什么荧光的。不过我之前做了AP的MTT实验，发现它对细胞几乎是没有损伤作用的，感觉可以排除药物加进去后对细胞损伤而产生ROS使平均荧光强度增加。
  那我想问下老师：那我就先检测阴性组，设置好门后依次检测剩余的组别。分析的话就只比较正常对照组、损伤组和药物处理组的荧光强度吗？
  我是看到有的文献上是做了单纯药物组的，但我不知道为什么要做？因为只有很少的文献是做这一组的。望老师解答下，谢谢。

stef1981 · 发表于 2011-12-25 15:05:49

民间恺撒发表于 2011-12-25 12:47

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我的药物AP是孕激素的一个代谢产物，还真不知道是带什么荧光的。不过我之前做了AP的MTT实验，发现它对 ...

单纯药物组是用来排除药物的自带荧光的，你可以把实验分为两大组，一组用阴性细胞设门，检测正常组和损伤组的荧光强度；另一组用单纯药物组设门（把所有细胞调到阴性区域，原理同阴性细胞一样），检测药物处理组的荧光强度

民间恺撒 · 发表于 2011-12-26 14:04:16

stef1981 发表于 2011-12-25 15:05

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单纯药物组是用来排除药物的自带荧光的，你可以把实验分为两大组，一组用阴性细胞设门，检测正常组和损伤 ...

谢谢老师的回答。那老师您的意思是：我把原来单纯药物组的话就不用加探针了，当用单纯药物组设门后只检测药物处理组的荧光吗？这个和损伤组的可以直接比较了？谢谢。

民间恺撒 · 发表于 2011-12-26 14:07:46

niwanmao 发表于 2011-12-24 22:51

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这玩意儿我还真没做过，可以请stef1981战友回答一下。
按照我对这个原理的理解，我觉得这一个小时的凋亡水 ...

我在丁香园上看到有人这样说：在DCFH检测方法中，仅需将你染色的空白管（没处理，染色）作为阴性对照调节荧光信号，并将该管的荧光信号主峰置于直方图中间位置，这样不管你的实验时抑制还是促进均能反应出来。注：不染色的空白细胞可不用，即使要用也仅作为FSC和SSC电压调节用，不作为荧光信号调节。
2.DCFH 是ROS 的俘获剂，空白对照细胞内正常成在ROS,一经染色同样具有较高的荧光细胞，故不能用不染色的空白细胞作为阴性对照，否则将出现荧光主峰右偏，不便实验结果分析。
不知道老师您的意见是？

民间恺撒 · 发表于 2011-12-26 14:09:57

本帖最后由民间恺撒于 2011-12-26 14:10 编辑

12-25.20000个细胞.rar (711.83 KB, 下载次数: 19) 这是我昨天做的结果。

stef1981 · 发表于 2011-12-26 15:09:40

民间恺撒发表于 2011-12-26 14:07

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我在丁香园上看到有人这样说：在DCFH检测方法中，仅需将你染色的空白管（没处理，染色）作为阴性对照调节 ...

阴性一般都要用，可以反映你的荧光探针是否失效，如果荧光探针很弱了就不能反映出变化，如果荧光很强还可以人为地左调

民间恺撒 · 发表于 2011-12-26 16:20:52

看了很多文献，貌似都只把正常组、损伤组和给药组放在一起统计了，这个就可以说明问题了吗？谢谢。

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