补偿的问题

liuxin · 发表于 2012-1-4 20:46:27

大家好，在做FoxP3，抗体用得是CD4-FITC ,CD25-PC5 ,Foxp3-PE,当时的考虑是Foxp3的表达量少选一个荧光较强的，但是现在遇到的问题是，做补偿怎么办？标CD4的也需要和FOxp3一样进行整个破膜的过程吗？还是补偿都差不多，只需要掉一个其他的补偿比较好？大家有什么好的建议？另外大家对同样的动物不同的组织（eg血标本，脾标本）用同样的抗体，两者的补偿的差异怎么看？不同的种属的呢？当然是在同一台机器上做。

niwanmao · 发表于 2012-1-5 08:37:19

我说说我的看法吧，仅供参考：

CD4、CD25是表面标记，先按照正常步骤进行标记，最后进行固定、破膜，标FOXP3。
详细步骤见：http://www.flowcyto.cn/forum.php?mod=viewthread&tid=215

关于补偿，我觉得你可以做一管CD4 FITC、CD25 PC5，不做FOXP3，用这管含两个抗体的标记，调节FL2-FL1和FL2-FL3的补偿，就差不多了，因为FL1-FL2基本上都在1％以内，FL3-FL2也是1％以内，而且你的FOXP3是PE标记的，主要要排除的就是FL1和FL3对它的影响了，所以这两个通道影响排除掉了，也就可以了。

不同种属、不同的组织都要单独做一管CD4、CD25，用来微调它独有的补偿。

liuxin · 发表于 2012-1-5 09:30:01

本帖最后由 liuxin 于 2012-1-5 09:38 编辑

niwanmao 发表于 2012-1-5 08:37

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我说说我的看法吧，仅供参考：

荧光图

真是获益匪浅~！这是荧光图，按照老师您的说法应该是很可行的。今天去试一下。是不是调荧光补偿的CD4 CD25不进行固定破膜的步骤可行吗？应该不行~？

niwanmao · 发表于 2012-1-5 11:07:39

liuxin 发表于 2012-1-5 09:30

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真是获益匪浅~！这是荧光图，按照老师您的说法应该是很可行的。今天去试一下。是不是调荧光补偿的CD4 CD2 ...

不固定破膜即可，固定破膜之后FSC-SSC可能会发生改变，但补偿应该不变。

一成天 · 发表于 2012-1-5 14:40:25

支持倪老师的做法

sunshinetao · 发表于 2012-1-7 15:53:53

学习了

liuxin · 发表于 2012-1-8 20:52:12

本帖最后由 liuxin 于 2012-1-8 21:09 编辑

niwanmao 发表于 2012-1-5 11:07

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不固定破膜即可，固定破膜之后FSC-SSC可能会发生改变，但补偿应该不变。

前几天没来，我做的时候是破膜固定，而且全都做了，可行~结果和老师说的差不多
但是又有新的问题，CD25表达怎么变低了？不知道当CD25荧光通道的电压偏低的时候是不是会影响结果。

niwanmao · 发表于 2012-1-8 21:44:28

liuxin 发表于 2012-1-8 20:52

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前几天没来，我做的时候是破膜固定，而且全都做了，可行~结果和老师说的差不多
但是又有新的问题，CD25表 ...

按照我平时的经验，固定之后，FSC/SSC/各通道的荧光强度都会发生不同程度的改变（视破膜剂不同而不同），但不会很大。从这个图上看，感觉CD25的电压还可以稍微调高一点，因为似乎有一小部分细胞在地平线下面。

liuxin · 发表于 2012-1-10 08:23:05

niwanmao 发表于 2012-1-8 21:44

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按照我平时的经验，固定之后，FSC/SSC/各通道的荧光强度都会发生不同程度的改变（视破膜剂不同而不同）， ...

谢睨老师，谢谢各位FLOWER.还有问题，将另发贴。

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