同型对照的上机

CRP

请问大家一个基础的问题，关于同型对照我理解其设置的目的与意义，以前流式实验我都没用过同型对照的，这次有了，比方我做一个2色的检测，是先调补偿呢？还是先上同型对照？或者说这两个需要怎样的协调？另外单染调补偿是否需要加入另外一个的同型对照？
以2色实验为例，CD3-FITC，CD4-PE，上机时我应该怎么设计样品？先后次序如何？请教高手指点！
先谢谢您了！

gcz5340

首先针对CD4、CD8这些常见的分子，阴性和阳性分的很开，这时候我个人觉得没必要做同型对照，因为marker线差一点点根本不会影响它的百分比。像有些抗原检测，它是连续性表达的，阴性阳性连在一起，这时候就必须设置同型对照。
回到你刚才的问题，我觉得应该是先上单标调补偿，然后上同型对照确定marker线。
其实严谨的话应该这样，以我们这边一个实验为例，三色CD38-FITC、CD34-PE、CD19-PeCy7，对照组如下：
        blank：调电压；
        FITC单标：调补偿；
        PE单标：调补偿；
        PeCy7单标：调补偿；
        FITC FMO对照：加FITC-IgG，CD19-PeCy7和CD19-PeCy7；
        PE FMO对照：加FITC-CD38，PE-IgG和CD19-PeCy7；
        PeCy7 FMO对照：加FITC-CD38、PE-CD34和IgG-PeCy7。
FMO（荧光减一对照）来确定marker线，不知道论坛里有没有介绍，你可以查一下。

个人一点体会，等待倪老师来补充。

CRP

gcz5340 发表于 2012-2-29 22:13

                               
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首先针对CD4、CD8这些常见的分子，阴性和阳性分的很开，这时候我个人觉得没必要做同型对照，因为marker线差 ...

您说的很好，很专业，请问我可以加您QQ好友吗？我有N多问题需要解决，先谢谢您了!

stef1981

gcz5340介绍得很详细，但个人觉得单标补偿仅能作为参考，不能以此来绝对确定marker线。因为单标只加了一种荧光，双标和三标加的荧光素比较多，就算调了补偿，细胞整体（包括阴性细胞）荧光强度也会向右上角偏移，超出marker线，造成误差。
我们通常就不用单标补偿了，而是双标补偿。比如说做免疫分型，先上CD117-PE/CD7-FITC，选成熟淋巴细胞，对FL1调补偿，因为成熟淋巴细胞上只有CD7没有CD117。然后用CD10--PE/CD19-FITC，选成熟粒细胞，对FL2调补偿，因为成熟粒细胞上只有CD10没有CD19。做其它检测也是同样的道理，必须结合自身实践，再适当调整，也不能太严谨。一点见解，不对请指正。

niwanmao

CRP 发表于 2012-2-29 22:25

                               
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您说的很好，很专业，请问我可以加您QQ好友吗？我有N多问题需要解决，先谢谢您了! ...

了解你的心情，很希望有个人直接帮你把所有问题一股脑儿解决掉。

但是，老实说，我的观点是，QQ真的只适合一般性的聊天，技术交流在论坛上最适合，因为把交流通过论坛帖子的方式公开出来，一大批的人都能看到，这个时候，大量观点的碰撞，经常会擦出火花，而且这些讨论过程给后来者看，后来者有时候问题都不需要提，直接就能看到解决方案。相当于这个过程既帮助自己，又使所有人都受益。

gcz5340

同意倪老师观点，有问题开新帖，方面后面学习的人。

CRP

niwanmao 发表于 2012-3-1 10:33

                               
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了解你的心情，很希望有个人直接帮你把所有问题一股脑儿解决掉。

但是，老实说，我的观点是，QQ真的只适 ...

好吧，谢谢您的帮助

bluefishcyl

marker线 是什么意思？

niwanmao

bluefishcyl 发表于 2012-9-13 21:04

                               
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marker线 是什么意思？

就是一条线段，界定阳性区域或者阴性区域，或者界定某种表达强度的区域，一般软件里面用M加数字表示，所以称为marker

yoyo13146905

楼上，我想请教一下，有的机子有三个激光，有不同的通道，请问是不是也用高表达的细胞和不表达的细胞也组成两两对照，谢谢。