实验指导，恳请大家帮助

CRP

大家好，我做Th1&Th2的流式分型检测，最近在写方案，但是还是有一些问题搞不明白，请大家帮帮忙。
         我的细胞表面分子是CD3+-PerCP-Cy5.5、CD8- -Texas Red、胞内细胞因子是IFN-gamma-FITC和IL-4-PE，初始细胞是MACS分选的Naive T细胞，对于流式的分型检测有以下疑问：
          1.  染色的时候，是先染表面分子，而后再染胞内细胞因子，还是一起染？
          2.  同型对照是加在一个管子里吗？包括细胞表面分子和胞内细胞因子四个同型对照
          3. 同型对照确定marker线？marker线是个什么概念？应该是文献里的M1之类吧，这个怎么确定，是同型对照与阳性区域接壤的线吗？
          4. 单染调补偿时，同型对照里面除了加该标示，还要加其他分子的同型对照，这个对于我的实验也是一样吗？以前上机时候，没有同型对照，调补偿，就是调节各个通道的电压，使得细胞分布恰当，现在同型对照加上后还需要调节什么？或者说怎么评估我调节好了？

            我是既不学医，也不搞免疫，我们这里管流式的不是专业的老师，人家还是学生态学的，所以我们都不懂，找个人也不方便，问题也很基础，现在课题需要，请大家帮忙了，谢谢您了！

特别感谢上次郭老师和倪老师的指导。

我用的是BC的机子，xl。

niwanmao

1、先染表面分子，染完之后，固定、破膜，再染胞内细胞因子。
2、同型对照单独设置，设置方法参考上次郭老师告诉你的方式：http://www.flowcyto.cn/forum.php ... d=1353&pid=4858
3、MARKER线其实就是你说的文献里的M1之类的，这个M1的左边界是阳性、阴性分界，是根据同型对照定的，最好根据2当中的FMO。右边界是你认为的阳性最大值。
4、调节可以参考2里面的提示。

CRP

niwanmao 发表于 2012-3-2 08:52

                               
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1、先染表面分子，染完之后，固定、破膜，再染胞内细胞因子。
2、同型对照单独设置，设置方法参考上次郭老 ...

就是说，我在调补偿的时候，只是设计每个单标即可，不用管同型对照？而我要确定maker线是需要做那个FMO的。因为我是四色的，所以会有四个单标的管调补偿，4个FMO对照，能去么请问，我调补偿和同型对照之间是有没有关系呢？调单标的补偿不需要相应的同型对照吗？或者说补偿与同型对照之间有需要协调的东西吗？

谢谢您了！

ddn111

调补偿做单标就可，调好后上多标验证下就行；
CD3和CD8没必要做同型，分离度好，画十字没压力；
FITC和PE做FMO比较关键，这个应该是区分阴阳性的依据，FMO中的减一可以不加该种抗体或用同型抗体替。

另，应该考虑做活化对照，测个CD69啥的，否则CK测不到阳性的话好分析原因！

CRP

ddn111 发表于 2012-3-2 10:12

                               
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调补偿做单标就可，调好后上多标验证下就行；
CD3和CD8没必要做同型，分离度好，画十字没压力；
FITC和PE做 ...

CD3和CD8的同型对照已经买了，所以还是做上吧。
您的意思是说，做FMO可以不做，另外两个染料，只做PE和FITC？然后这个用抗体和同型都可以，只要染料符合即可。
CD69的活化我也做的，只是我的机子是BC的，只有4个通道，我打算先做个检验活化的，确定成熟的刺激方案，再做四色。

谢谢您的帮助！

niwanmao

CRP 发表于 2012-3-2 09:11

                               
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就是说，我在调补偿的时候，只是设计每个单标即可，不用管同型对照？而我要确定maker线是需要做那个FMO的 ...

IFN-gamma FITC和IL-4 PE这两个标记我记得表达率是很低的，而且阳性细胞的荧光强度也不是很高，如果用它们来调节FITC和PE补偿我觉得不合适。
我的看法是（借用一下gcz5340的表格修改一下）：
        blank：调电压；
        FITC和PE之间的补偿可以参考该机器的常规数值。
        PerCP-cy5.5 单标：调补偿；
        FITC FMO对照：加FITC-IgG，CD3-PerCP-Cy5.5、CD8- -Texas Red、IL-4-PE；
        PE FMO对照：加PE-IgG、IFN-gamma-FITC、CD3-PerCP-Cy5.5、CD8- -Texas Red；
        PerCP-cy5.5 FMO对照：加PerCP-cy5.5、CD8- -Texas Red、IL-4-PE、IFN-gamma-FITC。

ddn111

CRP 发表于 2012-3-2 11:00

                               
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CD3和CD8的同型对照已经买了，所以还是做上吧。
您的意思是说，做FMO可以不做，另外两个染料，只做PE和FI ...

提醒一点的是，表面CD69和胞内CD69是有差异的！我指的对照是胞内CD69！用来确定胞内染色是否成功！而表面CD69的标志刺激很早就出现了！可用来确定刺激效果！

CRP

ddn111 发表于 2012-3-2 13:38

                               
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提醒一点的是，表面CD69和胞内CD69是有差异的！我指的对照是胞内CD69！用来确定胞内染色是否成功！而表面C ...

哦，那我搞错了，我还第一次听说这个，有相关文献吗？

CRP

niwanmao 发表于 2012-3-2 13:03

                               
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IFN-gamma FITC和IL-4 PE这两个标记我记得表达率是很低的，而且阳性细胞的荧光强度也不是很高，如果用它 ...

谢谢倪老师！
我用的是文献中经典的Th分型条件来活化细胞的，有很多细胞因子参与，应该不会阳性率低，当然这只是伦理上来说。
FITC和PE之间的补偿可以参考该机器的常规数值。，这个我不理解，常规数值，How I  get  it？

niwanmao

CRP 发表于 2012-3-2 21:01

                               
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谢谢倪老师！
我用的是文献中经典的Th分型条件来活化细胞的，有很多细胞因子参与，应该不会阳性率低，当 ...

你们平时应该做过其他fitc，pe的标记吧？就是做那些标记的时候电压、补偿可以拿来做参考。