利用流式细胞仪分离人类女性卵巢中的雌性生殖干细胞

a2782953

   最近看了一篇文献，是关于雌性生殖干细胞分离的文章，这里跟大家分享一下，然后我自己对这篇文章里的流式细胞仪图片还不太懂，在篇末向大家请教一下，还请不吝赐教。
   这篇文章的作者Jonathan L Tilly教授2004年在Nature上发表了一篇足以颠覆繁殖学基础的文章：通过一系列实验初步验证后，提出在雌性成年小鼠的卵巢中存在一种具有有丝分裂活性的细胞，这种细胞可以在成年小鼠卵巢中通过有丝分裂对丢失的卵细胞进行补充。虽然这一结果遭到了很多人的质疑，但是，2009年上海交大吴际团队的发现进一步证实了这一结果：吴际教授的团队利用免疫磁珠分选技术，利用一个生殖细胞特异性的抗原 MvH ，从成年雌性小鼠的卵巢中筛选出了能够在体外稳定传代6个月（至发稿时）的雌性生殖干细胞，并且在移植到事先用白消安及环磷酰胺处理过的雌性受体卵巢后能生成正常的卵细胞，并且能够产生正常后代（这一结果发表在natur cell biology）。经过三年时间后，Jonathan L Tilly教授于2012年在nature medicine上刊出文章：他们利用流式细胞仪细胞分选技术从育龄期人类女性卵巢中分选出了人类的雌性生殖干细胞，这种细胞已经在体外稳定传代了18个月（至发稿时），并且经过异体移植实验表明这种雌性生殖细胞可以在卵巢皮质部经过有丝分裂产生卵母细胞。这一结果确实具有巨大的突破性意义，但是显然，结果中还有一些不如意的地方，比如：无论是从小鼠中分离到的还是从人类女性卵巢中分离到的所谓的雌性生殖干细胞，在体外培养过程中总是会自发的分化并产生类似于卵细胞的卵圆形细胞，而且经过一系列验证，发现其特性跟卵细胞基本一样。这个结果至少表明：雌性干细胞的体外培养体系仍然需要改进。但是，这无法掩盖这一巨大发现的光芒。下面是Jonathan L Tilly教授在实验中使用流式细胞仪分离小鼠雌性生殖干细胞的一个大概过程（这里用小鼠是因为在这篇文章中，先用小鼠验证了用流式细胞仪可以分选出FGSCs，而我不懂的地方就在这里。但是用于分选人类雌性生殖细胞的技术跟这个步骤一样）。

    作者在分选中所标记的雌性生殖干细胞特定抗原是MvH（Ddx4）蛋白，MvH（Ddx4）蛋白在生殖细胞中特异表达且是一种胞质内蛋白，但是这个蛋白的位置会随着雌性生殖细胞的成熟过程呈现不同的定位位置：在雌性生殖干细胞的时候，其COOH基端会形成跨膜结构域从而可以在雌性生殖干细胞的膜表面呈现，而随着卵细胞的成熟，其蛋白的COOH基端会进入胞质。
   因为作者Jonathan L Tilly教授在实验前对MvH蛋白的COOH端是否在细胞膜表达仍然心存疑虑，所以他根据生物信息学预测后，对MvH基因表达蛋白的COOH端和NH2端分别设计了抗体：针对COOH端的是兔的多抗（下面就称为COOH端抗体），针对NH2端的是羊的多抗（下面就称为NH2端抗体）。首先对COOH端是否在雌性生殖干细胞的膜表面表达进行了初步验证。
   将雌性小鼠的卵巢制成单细胞悬液后，利用1%无脂肪酸的BSA和1%的普通羊血清（接下来用COOH端抗体反应）或者1%的普通驴血清（接下来用NH2端抗体反应）封闭，之后细胞与一抗反应（COOH端抗体或者NH2端抗体）。清洗细胞后再与二抗反应：用APC标记的羊抗兔IgG或者用Alexa Fluor 488标记的驴抗羊IgG，清洗。利用BD Biosciences FACSAria II cytometer 分选细胞，gated against negative(unstained and no primary antibody）controls。下面是图片。
        哇哇哇！！！图片没法上传啊。。。晕！！崩溃啊。。。来个附件吧，麻烦大家了！
   啊啊啊啊！！！！！附件 也没法上传啊！！！我真郁闷了，我白打了半天字了吗？！！ 斑竹，你那里有这篇文章吧？我把文章名字给你，你可否帮我看下这篇文章的图1部分，我真看不懂啊 ，所以我才打了半天字，真心想请教啊！！我崩溃了要！！

      
题目：Oocyte formation by mitotically active germ cells purified from ovaries of reproductive-age women
       摘要链接：http://www.nature.com/nm/journal/vaop/ncurrent/full/nm.2669.html
      
         我最看不懂的是图1 c中：
         1.为什么NEG只划那么一小片，为什么不圈住所有那片细胞？NEG外的不都是阳性细胞么，那按文中所画的，还有一大部分阳性细胞不是Ddx4阳性的细胞啊！
         2.为什么Ddx4阳性的细胞在只添加COOH端抗体后，在Anti-rabbit-APC轴上没有体现（Ddx4阳性细胞在水平方向都和NEG水平，或者还低！），反而在Anti-goat-488 轴上体现(水平右移出来）出来了？
         3.为什么在图1 c 的第二张图，就是中间那张图上，细胞没有通透的时候且只添加了NH2端的一抗，这个时候很明显应该是两个二抗都不可能结合上的（因为要通透后NH2端抗体才能进入细胞），为什么图中还有细胞存在？不应该没有细胞么 ？
         4.这个图显示的纵轴是Anti-rabbit-APC，横轴是Anti-goat-488，那这个意思是用于分离的细胞同时与两个二抗都孵育了，但是只是在一抗上的区别（添加或者没添加）？
         
       我对流式细胞仪真的不懂，虽然我已经找了一堆资料来研究了。。。但是我想弄清楚这个是怎么回事，请各位朋友帮我下，看下这篇文章，回答下我的问题吧！我真心感谢了！
   

niwanmao

a2782953 发表于 2012-3-11 14:35

                               
登录/注册后可看大图

我太心急了，我去看下论坛中的自发荧光及对照设置部分。。呵呵

你需要看一下ATTACHMENT中的方法学部分（http://www.nature.com/nm/journal/vaop/ncurrent/extref/nm.2669-S1.pdf ），我选择其中流式这部分方法如下：
Flow cytometry For each experiment, ovarian tissue (mouse: four ovaries pooled; human: 10 X
10  X 1 mm thick, cortex only) was dissociated, blocked and reacted with primary antibody
(ab13840 for detection of the COOH terminus of Ddx4 and DDX4, or AF2030 for detection of
the NH2 terminus of Ddx4 and DDX4) as described above. After washing with HBSS, cells were
incubated with a 1:500 dilution of goat anti-rabbit IgG conjugated to Alexa Fluor 488 (Invitrogen;
ab13840 detection) or donkey anti-goat IgG conjugated to Alexa Fluor 488 (Invitrogen; AF2030
detection) for 20 min on ice, and washed with HBSS. Labeled cells were then filtered again (35-
μm pore diameter) and subjected to FACS using a BD Biosciences FACSAria II cytometer
(Harvard Stem Cell Institute), gated against negative (unstained and no primary antibody)
controls. Propidium iodide was added to the cell suspension just prior to sorting for dead cell
exclusion. Freshly-isolated Ddx4-positive (mouse) and DDX4-positive (human) viable cells were
collected for gene expression profiling, assessment of teratoma formation capacity or  in-vitro
culture. For some experiments, cells were fixed in 2% neutral-buffered paraformaldehyde (PFA)
and permeabilized with 0.1% Triton-X100 prior to reaction with primary antibody against the NH2
terminus of DDX4 (AF2030) and detection by FACS after reaction with donkey anti-goat IgG
conjugated to Alexa Fluor 488. For re-sort experiments, viable cells were reacted with DDX4-
COOH antibody (ab13840) and sorted by FACS after reaction with a goat anti-rabbit IgG
conjugated to allophcocyanin (APC) (Jackson Immunoresearch). Resultant APC-positive (Ddx4-
positive) viable cells were either left intact or fixed and permeabilized prior to incubation with
DDX4-NH2 antibody (AF2030), followed by incubation with donkey anti-goat IgG conjugated to
Alexa Fluor 488 and analysis by FACS.


所以，我的看法如下，请大家一起讨论：
1.为什么NEG只划那么一小片，为什么不圈住所有那片细胞？NEG外的不都是阳性细胞么，那按文中所画的，还有一大部分阳性细胞不是Ddx4阳性的细胞啊！
NEG是指空白或不加一抗的标本，NEG外不全是阳性细胞，之所以发生偏移，跟间接标记有关。


2.为什么Ddx4阳性的细胞在只添加COOH端抗体后，在Anti-rabbit-APC轴上没有体现（Ddx4阳性细胞在水平方向都和NEG水平，或者还低！），反而在Anti-goat-488 轴上体现(水平右移出来）出来了？
注意方法学中，针对COOH的二抗不只是ANTI-RABBIT APC，还有一个ANTI RABBIT AF488,所以FIG 1.C的第一个图就是利用ANTI RABBIT AF488标记产生的阳性信号，就是FIG 1.C都是AF488信号，都只看横坐标，纵坐标是没有信号的。其实作者做FIG 1.C的时候应该是有点粗心，在这FIG 1.C中ANTI RABBIT APC应该是没有用的，应该把FIG 1.C的三个小图分开来写：ANTI RABBIT AF488、ANTI GOAT AF488、ANTI GOAT AF488 。

3.为什么在图1 c 的第二张图，就是中间那张图上，细胞没有通透的时候且只添加了NH2端的一抗，这个时候很明显应该是两个二抗都不可能结合上的（因为要通透后NH2端抗体才能进入细胞），为什么图中还有细胞存在？不应该没有细胞么 ？
FIG 1.C中第二个图的偏移是正常的间接标记的荧光偏移，不算阳性，只有处在DDX4区域中的那部分才算阳性。


4.这个图显示的纵轴是Anti-rabbit-APC，横轴是Anti-goat-488，那这个意思是用于分离的细胞同时与两个二抗都孵育了，但是只是在一抗上的区别（添加或者没添加）？
是不是指FIG 1.C？如果是的话，就象我上面所说，是只标了AF488,只是三个小图分别是ANTI RABBIT AF488、ANTI GOAT AF488、 ANTI GOAT AF488 。

stef1981

文章下不下来，图也看不清，想办法把图传上来

niwanmao

我先把图和文件传上来。内容比较多，问题我看过了，文章没时间看，现在有事情先出去一下，晚上回来再看看：）大家先讨论起来吧（文章原文： Oocyte formation by mitotically active germ cells purified from ovaries of repro.pdf (1.16 MB, 下载次数: 10)

2012-3-11 11:11 上传

点击文件名下载附件
Oocyte formation by mitotically active germ cells purified from ovaries of reproductive-age women
阅读权限: 10

，原来的文件是有2兆多，超过我们允许上传的大小，所以楼主传不上来是正常的，抱歉，以后搞到性能更好的服务器，我们会增加文件上传大小的。）

FACS-based protocol for OSC isolation

gcz5340

首先感谢楼主有这么好的案例还分享啊，文章没怎么看懂，就流式部分回答一下，个人观点欢迎补充：

1、做流式一般都要有对照的，图中NEG那个框应该是根据空白对照来定义的，因为文章中实验都是间标（流式中一般主要的还是直标）而且还是多抗，所以非特异性很厉害也很正常，所以实验组的本底荧光增强超出框外，这时候就需要细胞群体分群情况来区分阳性和阴性，所以文章中用一个Ddx4的框来定义阳性population。一般来说这种经验性的设门主观性还是蛮大的，但是试验中各个组之间还是有差异的，所以楼主也不用质疑这点。

2、我觉得文章这个图中横纵坐标应该是这样理解，首先COOH代表只加了COOH的一抗，NH2代表只加了只加了NH2一抗，横纵坐标的APC和AF488代表两种二抗每个组都加了，所以横纵坐标应该不是我们平时看到的流式图中AF488和APC的荧光表达强度的意思。按图中的意思，横坐标就代表Ddx4的表达量，纵坐标你就不要管了。

3、没通透只加NH2一抗，二抗确实是特异性结合不上的，但是还要考虑到非特异性结合上的荧光以及细胞的自发荧光，这些微弱的荧光流式细胞仪都能检测到，所以细胞点点流式图中还是有的，只是在阴性的位置。具体可以参照论坛中自发荧光以及对照设置部分。

4、这个问题2中已经解释。

a2782953

非常感谢以上两位版主stef1981和gcz5340及站长对我问题的关注！谢谢你们！ 感谢gcz5340斑竹对我问题的解释，我会再结合相关流式的基本知识再对这些解释进行消化！另外也欢迎对这个文章有不同理解的朋友发表自己的观点！

a2782953

另外，有同学说 NEG部分是根据同型对照来划定的，不知这个同型对照和空白对照有什么区别？

a2782953

我太心急了，我去看下论坛中的自发荧光及对照设置部分。。呵呵

a2782953

niwanmao 发表于 2012-3-11 21:27

                               
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你需要看一下ATTACHMENT中的方法学部分（http://www.nature.com/nm/journal/vaop/ncurrent/extref/nm.266 ...

正如老师所说，我一直看不懂的就是作者的这个图，当时怎么想都不明白，后面的补充材料中也看了，当时看完后跟图一结合，更晕了。。。呵呵，谢谢老师的详细解答，但是我还是有另一个疑问，麻烦老师了！
      
      1.如果c图是这样的话，那么d图是不是也认为坐标轴的标识是不合适的 ？

      2.作者在这个文章中没有用同型对照吧，我看补充材料中也没说这个？
     
      3.关于同型对照的问题，我把咱们这个网站上所有有关的问题都看了，并且也在网上找了其他资料，可是我越看越迷糊啊： * 这同型对照有的说要加荧光标记，有的说不加，到底是加呢还不是加呢？*说同型对照的作用是确定一抗的结合是特异性的，而不是非特异性的Fc受体或与其他蛋白的相互作用。那他如何确定呢？*同型对照（Isotype Control）的概念是：使用与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同的免疫球蛋白及亚型的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的 背景染色。在这个概念中“与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同的免疫球蛋白及亚型的免疫球蛋白”我一直理解不透，再结合我在咱们这个网站上看的东西，我越来越觉得，这个不就是说的一抗本身么。。。例如，如果一抗为 FITC 偶联的小鼠 IgG1，则需要选择 FITC 偶联的小鼠 IgG1 同型对照，全是小鼠IgG1。。。。还有这句“用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的 背景染色”，他是如何消除的呢？难道说是用了同型对照的抗体后，那个抗体不会与目标抗原结合，只会覆盖目标一抗非特异性结合的位点？

    我难道太笨了，想不通啊。。。老师，还请解答下我上面的问题，如果因为一些问题太幼稚而没办法解答的话，直接说再看资料  我继续看资料啊！
         
      
      

a2782953

niwanmao 发表于 2012-3-11 11:12

                               
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我先把图和文件传上来。内容比较多，问题我看过了，文章没时间看，现在有事情先出去一下，晚上回来再看看： ...

倪老师：

     刚才我跟文章的作者联系了一下，作者说 他们之所以把Anti-rabbit-APC标到纵坐标上是因为他们利用APC通道来排除自发荧光。“We ruled out autofluorescence using the APC channel, which is why we have labeled it on that axis.”，另外他还说  文章中 Figure1 C 的注释  ：1c:  FACS plots from the analysis of live or
permeabilized cells from dispersed mouse ovaries using antibodies against the N or C terminus of
Ddx4. Viable Ddx4-positive cells were only detected with the COOH antibody (red dashed box,
reacted with anti-rabbit-APC), whereas permeabilization enabled the isolation of Ddx4-positive cells
using the NH2 antibody (blue dashed box, reacted with anti-goat-488). Here i marked my confused part.  就彩色部分  应该是   anti-rabbit-488.
     不过我还是不明白，如何使用anti-rabbit-APC来排除自发荧光呢 ？麻烦了。。。