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发表于 2012-3-13 22:10:30
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zhchzh87 发表于 2012-3-13 16:03
谢谢，我说错了，的确是计数细胞，不过抗体标记的是这种细胞的标志蛋白。有人说还需要同型对照，是吗？同 ...
如果你所测的胞内蛋白表达强，阳性阴性区分清楚，那么同型对照不需要也行。如果表达很弱或者很少，那么同型对照或者fmo对照还是需要的。
FMO设门对照在那些阴性、阳性细胞群体分布不清晰的样本中至关重要。某些活化标志物，如CD25、CD38、CD69和一些细胞因子都属于此范畴。对于这些标志物的设门对照可能是生物对照样本（未刺激样本或无效刺激样本），或使用更为通用的对照，如同型对照或荧光扣除对照（FMO）。
同型对照
同型对照在流式细胞仪中应用已有很长历史，用于定义某一荧光标记抗体在染色中的非特异性结合。找到与抗体匹配的同型对照十分重要，图2说明了不同亚型抗体的同型对照具有不同的染色本底。然而，即使同型对照与抗体相匹配，使用此同型对照还主要存在两大不足。第一个不足是每个荧光标记抗体都具有特定的染色本底，取决于它们的特异性、浓度、聚集程度、荧光分子数量/抗体比例及其他因素。因此寻找一个与抗体染色背景完全匹配的同型对照是很难的。但是我们却是使用同型对照来帮助定义背景染色的水平，因此这是不足之一。第二点不足是同型对照其本身并不能定义由其他荧光通道渗漏而来的荧光。这个问题可通过在染色时除同型对照外还加入所有其他通道的抗体来解决。但即使这个问题全部解决，仍会受第一点不足的影响，即无法找到与染色抗体背景信号完全一致的同型对照。
FMO CONTROLS
当使用一定浓度的高质量荧光标记抗体时，它们此时的染色本底相对较低。在这种情况下，如果在检测中运用荧光数量>4时，此时的染色本底基本源于荧光渗漏。因为这个原因，使用荧光扣除对照变得流行并更为谨慎。FMO对照是指样本中加入除一个抗体以外的所有染色抗体。没有加入抗体的通道中信号则是FMO对照所提供的设门界线。
了解FMO对照能够提供和不能提供什么信息十分重要。它能提供测量由其他通道渗漏而来的信号的线索。故它在测试新的多色方案，需要在某一通道中获得最高分辨灵敏度时十分重要。因为在所研究的通道中并不存在任何抗体，FMO对照并不能提供该通道抗体实际染色本底的情况。当抗体染色本底与荧光渗漏引起的本底相比并不重要时，以下情况便无需担心了。但是如果抗体染色样本显得更为重要时，单独使用FMO对照来决定阴性/阳性界线便不再适合了。一个重要问题：FMO或同型对照是否在每个实验中的每个样本都进行检测。一般来说，实验者不希望出现不同样本源染色时荧光渗漏量发生显著变化，但因为不同抗体结合浓度不同而造成荧光渗漏也不尽相同。同样的，抗体染色本底应该相对稳定，但由于样本之间的差异其本底也会有所不同。因此，最保守的方法是为每个样本都作对照，但如果进行大批量检测时，这可能会显著增加成本及劳动量，所以此时会对样本检测其对照是否存在差异。
简言之，同型对照和FMO对照是最为常用的设门对照。本节前半部分讨论了由于抗体非特异结合而形成的本底，但通过同型对照并不能为所有的抗体精确去除本底信号。后半部分讨论了由于荧光渗漏而引起的本底信号。FMO对照则通常在多色分析中使用，去除由于荧光渗漏而引起的本底信号。并不是在检测任何指标时都需设立这些对照，只是当阳性、阴性群边界不清时需要设立。 |
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发表于 2012-3-13 15:04:27
