胞内因子检测问题分析

CRP

我是用PMA（25ng/ml）+inon（1ug/ml）刺激细胞6h后检测，从图上看，细胞表面的CD69分子从11.49%经刺激后，表达增多至49.85%，而胞内的CD69分子从12.81%经刺激后，表达增多至31.3%。问题：

1）  有资料说是，经由PMA+inon刺激后，CD69表面和胞内的表达会大于90%,而我的显然不足，请问这个说法正确吗？如果正确，我的阳性率不足一般会由什么造成呢？

2）  按照目前的活化程度，可以进行胞内细胞因子的染色吗？

3）  有什么胞内因子染色的经验可以分享一下吗？

感谢您的帮助！

niwanmao

CRP 发表于 2012-4-23 13:09

                               
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那就奇怪了，浓度不准确，也不至于会差很多，PMA的刺激浓度很宽泛的，真愁啊 ...

CD69质控的检查是这样的：
首先用SSC－CD3点图，选择CD3高表达的细胞（即T淋巴细胞），设为R1门，不要用FSC－SSC点图来圈，因为加了PMA刺激之后，红细胞不容易裂解。

然后，画一个直方图，分析R1门内细胞CD69的阳性率。如果胞膜的CD69阳性率>90％，才说明通过了第一步质控，才能进行第二步胞内的质控，只有第二步胞内质控也>90％，那时候才说明刺激正常，才说明细胞因子结果可用。

任何一步通不过，就得检查自己实验步骤或试剂是否正确。

你可以先按照上面的分析方法再分析分析你的CD69结果看，如果不行，试试调整PMA和Ionomycin的浓度或量。

luxj807

PMA+inon刺激后，CD69表面和胞内的表达确实是会大于90%,而且这个是一个质控条件。我想是不是在配制PMA和ION时浓度不准确。

CRP

luxj807 发表于 2012-4-23 12:43

                               
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PMA+inon刺激后，CD69表面和胞内的表达确实是会大于90%,而且这个是一个质控条件。我想是不是在配制PMA和ION ...

那就奇怪了，浓度不准确，也不至于会差很多，PMA的刺激浓度很宽泛的，真愁啊

CRP

niwanmao 发表于 2012-4-23 21:35

                               
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CD69质控的检查是这样的：
首先用SSC－CD3点图，选择CD3高表达的细胞（即T淋巴细胞），设为R1门，不要用F ...

我是用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞后，就加了红细胞裂解液除去红细胞的。

我明天试试您说的这个方式，看看效果

谢谢您了，倪老师

CRP

CRP 发表于 2012-4-23 22:17

                               
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我是用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞后，就加了红细胞裂解液除去红细胞的。

我明天试试您说的这个方式，看 ...

倪老师，那就是应该是检测CD3T淋巴细胞中的CD69的活化度，这样的话，可以不可以只看2区的PE表达量即可，这样的话，表面的CD69是25.54/25.76=99.14%;而胞内的是22.7/39.7=57.18%,不知这样理解可以吗？

今天本来像您说的那样做了，悲剧的是CD69竟然没染上色，数目很低，暂且认为是我加错同型处理。等明天做了再看！

CRP

niwanmao 发表于 2012-4-23 12:01

                               
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CD69质控的检查是这样的：
首先用SSC－CD3点图，选择CD3高表达的细胞（即T淋巴细胞），设为R1门，不要用F ...

倪老师，那就是应该是检测CD3T淋巴细胞中的CD69的活化度，这样的话，可以不可以只看2区的PE表达量即可，这样的话，表面的CD69是25.54/25.76=99.14%;而胞内的是22.7/39.7=57.18%,不知这样理解可以吗？

今天本来像您说的那样做了，悲剧的是CD69竟然没染上色，数目很低，暂且认为是我加错同型处理。等明天做了再看！

niwanmao

CRP 发表于 2012-4-24 17:07

                               
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倪老师，那就是应该是检测CD3T淋巴细胞中的CD69的活化度，这样的话，可以不可以只看2区的PE表达量即可， ...

再试试吧。

你是提取PBMC之后，再进行刺激呢？还是刺激之后，再提取PBMC进行检测的？

CRP

niwanmao 发表于 2012-4-24 17:29

                               
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再试试吧。

你是提取PBMC之后，再进行刺激呢？还是刺激之后，再提取PBMC进行检测的？ ...

先提取，再刺激的

今天我都不知道为啥没有染上PE，哎！

aninawang

PMA很容易失去刺激的活性的，最好是新鲜配制的。据文献说4℃不超过一周，不然刺激的能力会下降。贮存浓度最好是<-20℃保存，我们一般选择-80℃。