CFSE染细胞的一些问题

zark_00

请问有用CFSE染过细胞的战友么，我最近在用CFSE标记细胞，遇到一些问题：
1 用配好的CFSE染色液加入到细胞悬液中孵育染色后，需要向该混合液（染色液+细胞悬液）中加入FBS终止么，比例是多少，我用的比例是（混合液：FBS=2:1）。加入FBS的原因是什么？怎么保证能去除未染上细胞游离的CFSE?
2 CFSE染色原理是轻透过活细胞膜，被胞内酶水解，发绿色荧光，并长期停留在细胞内，不干扰细胞活动。请问染好CFSE的细胞，如果加以一定条件使其裂解，那胞内的CFSE还会重新释放出来成为游离状态么？如果能释放，这释放出来的是原始状态的，还是水解后状态的？释放出来的CFSE，能继续染上那些未被裂解的细胞么？
非常感谢

zark_00

运气实在不好，遇到瓶颈了~
做了几天我上一个帖子说的小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的实验。结果CFSE阳性的巨噬细胞很多，比例很高60%左右，最近一次100%接近。这个百分率是粗略看做吞噬率的。吞噬率100%是不可能的，60%的结果，我们用吉姆萨染片子油镜计数远远不及，30%左右。所以，在找原因。
突然想到，我有一步，鸡红细胞打进小鼠腹腔后，取出腹腔液，腹腔液用CD11b（MAC-1)染后，+氯铵盐裂解液裂解（鸡红细胞很多，不裂解直接上机的话，几乎看不到腹腔内细胞，跟全血一个道理）。我在想，裂解鸡红细胞后，会不会鸡红细胞胞内的CFSE就游离出来了，因为裂解也是室温10几分钟（染鸡红细胞也是室温10分钟），所以，如果有游离CFSE，会不会就在这10几分钟内，把刺激出来的巨噬细胞都给染了，所以造成巨噬细胞100%CFSE阳性。。。郁闷，如果这个假设成立的话，这个实验设计就不能用了，GAME OVER

zark_00

还有，像CFSE这种染料，是说在一定浓度情况下， 所有细胞都能染上？还是说有可能部分细胞染上，另一部分染不上（同一种细胞同一样品中）。
我觉得应该是都能染上，只是每个细胞被染上的多少而已（平均荧光强度有大小差别）

niwanmao

我暂时只能从理论上回答，因为毕竟我没有实际操作过，可以请samly0回答一下：

1、按照protocol（http://www.flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=viewthread&tid=567）里面的步骤，应该是加入5倍体积含10％FBS的冷培养基终止反应。原理我不太了解，会不会是因为FBS阻断的缘故？

2、染色完毕是通过洗涤3次把悬液中游离的CFSE洗涤干净的，但是重新释放，从原理上讲似乎应该可能性不大，都结合好了，是随代扩增而逐渐减弱的。http://www.flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=viewthread&tid=1492

niwanmao

zark_00 发表于 2012-5-12 23:45

                               
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还有，像CFSE这种染料，是说在一定浓度情况下， 所有细胞都能染上？还是说有可能部分细胞染上，另一部分染 ...

应该都能染吧。

niwanmao

zark_00 发表于 2012-5-12 23:42

                               
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运气实在不好，遇到瓶颈了~
做了几天我上一个帖子说的小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的实验。结果CFSE阳性的 ...

你的步骤是怎么样的？先用CFSE染红细胞，然后把鸡红细胞打入小鼠腹腔？

zark_00

niwanmao 发表于 2012-5-13 00:10

                               
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你的步骤是怎么样的？先用CFSE染红细胞，然后把鸡红细胞打入小鼠腹腔？

半体内法测小鼠腹腔巨噬细胞吞噬，用CFSE染鸡红细胞，然后往小鼠腹腔注射，然后取腹腔液，再加CD11b标记巨噬细胞，然后做裂解，离心弃上清两次后，重悬上机，找到CD11b+群体，向下设门看是否有CD11b+CFSE+群体及比例，这个比例就是吞噬了鸡红细胞的比例

niwanmao

zark_00 发表于 2012-5-13 07:51

                               
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半体内法测小鼠腹腔巨噬细胞吞噬，用CFSE染鸡红细胞，然后往小鼠腹腔注射，然后取腹腔液，再加CD11b标记 ...

从原理上讲，cfse进入细胞内后，被酯酶水解成具有荧光的基团，会牢牢结合在胞内蛋白质上，不会释放到胞外。不过我看你在担心红细胞裂解后，红细胞内游离出来的cfse是不是会结合到其他细胞膜上。我觉得不会，因为释放出来也是与蛋白质结合的cfse，还能有位点与其他物质结合吗？
当然，这些只是我从原理上的一些推理，还需要实际做过的朋友来谈谈。

另外，能否上传一下你的原始数据，我们一起看看会不会是其他原因。

zark_00

niwanmao 发表于 2012-5-13 08:39

                               
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从原理上讲，cfse进入细胞内后，被酯酶水解成具有荧光的基团，会牢牢结合在胞内蛋白质上，不会释放到胞外 ...

对，我分析时也在思考您刚才说的那个问题。裂解后出来的CFSE应该发生了变化，不能再结合别的细胞了。那是否是我染CFSE后，中止和洗涤得不干净？使染好的鸡红细胞悬液里有游离CFSE?染色10分钟后按（悬液：FBS=2:1）的比例+冷FBS，室温放置5分钟，然后离心，然后用生理盐水重悬离心3次。
今天比较忙，找个大的时间空挡，发图

zark_00

丁香园上找的CFSE染色的一些做法：
1.用什么培养液培养就用什么培养液重悬
2.染色时个人认为应该用含BSA的PBS重悬,我看到所有Protocol都是用它重悬的.平时在撤血清的时候使用的BSA的浓度是0.5-2%,这是质量体积比，但做CFSE染色时推荐用0.1%的BSA，以减少对染料的影响。
楼主对这几个概念要搞清楚:
FBS:胎牛血清
BSA:牛血清白蛋白,主要作用是替代血清的胶体渗透压
完全培养液:是含血清的

染色时应当是用含BSA的PBS,最好不要用含BSA的培养液,因为看到protocol上说培养液的成分也会影响染料效果.用含血清的培养液就更不行了,会终止染料的作用.我不知道有些战友为什么会用含血清的培养液,也许是我知识有限,但我看到的所有Protocol都要求在染色前完全去处血清成分.

3.CFSE的浓度非常重要，说明书推荐1-5uM.个人也验证过,对于我的细胞来说,低于1uM,就难以染上.1-5uM的染色效果就没多大差别了.不同的细胞需要的浓度不同,正式实验前需要先做个染料的浓度梯度,摸清楚最低的有效浓度.浓度太高的话可能对细胞有损伤.所以要用尽可能低的浓度.

细胞浓度没有特别限制,染色效率主要是跟染料浓度有关,染色的过程只有不到10min,染料始终是过量的.个人认为1*105左右的细胞用1-2ml染液是比较合适的.protocol推荐1×106/ml用于体外实验，5×107/ml用于示踪。各种条件还是自己摸一下吧。

染料的浓度是终浓度.楼主把握住这一点就可以了.
比如说吧,要求终浓度是5uM.
那么用5mM储存液2ul+1ml含BSA的PBS,就得到10uM的工作液.1ml工作液+1ml细胞悬液,就得到5uM的终浓度.
同样,用5mM储存液2ul+1.5ml含BSA的PBS,再加0.5ml的细胞悬液,这样的终浓度也是5uM.
工作液和细胞悬液的比例无所谓,重要的加入的储存液的量和最后的总体积.

4.终止标记，我看到的protocol都是用完全培养基来终止的,因为血清成分会终止染料的作用.楼主用的是悬浮细胞吧.建议配20%血清的培养液,终止时加入与染液等体积的培养液.如果是贴壁细胞的话,弃去染液,加入10%血清培养液就可以了.用40%体积的冷小牛血清应该也是同样的原理,也是用血清成分来终止染料的作用.
终止后需要放在37度培养箱孵育10min.
染色完成后就可开始接种.

5.染色完成后就可被观察到

6.用CFSE染色的细胞再做冰冻切片，这个我没做过,不知道对免疫荧光是否有影响
不过个人认为,从CFSE的染色原理来看,对细胞中的其他成分是没什么影响的.注意CFSE是绿色荧光

这是06年时某战友回复别人的