胞内细胞因子检测问题

CRP

请教大家一个问题，我是要检测某个蛋白药物对Th1、Th2分化的影响，最后用流式检测其分型的效果。一般来讲，检测细胞因子前要用到PMA+iono刺激，然后染色，但是我现在遇到的问题是，这样做的话，我的刺激组与未刺激组是以是否加蛋白为依据的，所以理论上所有的样品都要加PMA+iono来刺激，这样才能保证单一变量，但是我这么做了一次，发现蛋白刺激与未刺激组差异不是很大，我怀疑是否是PMA的刺激作用过强，而掩盖了蛋白药物的影响，那我应该怎么做呢？大家有无经验，是如何解决这种问题。
文献上，又说是加了PMA刺激的，有的是anti-CD3刺激，有的干脆啥也没说，不知道是否可以降低PMA用量？或者用anti-CD3来进行二次刺激（这个可能会相对刺激弱一些），要么直接染色？

先谢谢大家了！

niwanmao

这个药物是不是本身就有刺激作用的？那可以直接加嘛。
http://www.flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=viewthread&tid=1619第二页

或者，如果担心PMA作用的干扰，可以另外设一组单纯PMA，而无蛋白作用的。

CRP

niwanmao 发表于 2012-6-15 11:54

                               
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这个药物是不是本身就有刺激作用的？那可以直接加嘛。
http://www.flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=viewthre ...

有的，ELISA结果显示IFN-gamma上调明显

niwanmao

CRP 发表于 2012-6-15 12:03

                               
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有的，ELISA结果显示IFN-gamma上调明显

那就直接用蛋白药物刺激吧，不用PMA。

CRP

niwanmao 发表于 2012-6-15 12:08

                               
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那就直接用蛋白药物刺激吧，不用PMA。

那如果没有PMA的话，我检测胞内细胞因子的话，是否可以把蛋白转运抑制剂多作用一段时间，以前我是MN和PMA一起加，5h收集细胞染色，如果没有PMA的，可以让MN作用10h，这样理论上可以使得细胞因子留在胞内的更多,因为我看MN的作用时间，说明书上是不超过12h，不知道，这样是否有道理？

niwanmao

CRP 发表于 2012-6-15 16:38

                               
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那如果没有PMA的话，我检测胞内细胞因子的话，是否可以把蛋白转运抑制剂多作用一段时间，以前我是MN和PMA ...

理论可行。请有经验的朋友来谈谈吧：）

renping_jsnj

在实验设计上，我觉得目的主要是看你的蛋白的作用，所以直接用你的蛋白刺激就好，同时可以加一管PMA+ionomycin，作为对照起一个control的作用。
刺激的时间我看到的protocol一般是4-6h，我自己做的是4.5h，一天从上班做到下班时间刚刚好。我觉得如果4-6h你能看到明显的刺激作用，就不要去延长时间了，10h的孵育时间，后续操作要么很早要么很晚，人会挺累的。

CRP

renping_jsnj 发表于 2012-6-19 10:47

                               
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在实验设计上，我觉得目的主要是看你的蛋白的作用，所以直接用你的蛋白刺激就好，同时可以加一管PMA+ionomy ...

谢谢
一般来讲，胞内细胞因子刺激是4-6h，之所以这么短是因为PMA的存在，如果我直接用蛋白来刺激，不存在PMA，理论上MN存在时间越长阻抑分泌的细胞因子越多，我是这么想的

快有结果了，已经在做了

niwanmao

CRP 发表于 2012-6-20 09:24

                               
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谢谢
一般来讲，胞内细胞因子刺激是4-6h，之所以这么短是因为PMA的存在，如果我直接用蛋白来刺激，不存在 ...

是不是可以把同一批标本经过蛋白刺激之后，分成几份，设置不同时间段，看看效果？

CRP

niwanmao 发表于 2012-6-20 09:48

                               
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是不是可以把同一批标本经过蛋白刺激之后，分成几份，设置不同时间段，看看效果？ ...

这个有做过ELISA，我是参照那个的时间梯度选取的时间