4种荧光染色的，第一次做，请教各位老师

virginforest

原代，大鼠动脉组织，荧光试剂： FITC，PE，PEcy5.5，APC，仪器：Calibur
图1是空白的，图2,3是2个样品，4个荧光染色怎么调节补偿啊，一头雾水啊，请教各位老师指点下。
还有个问题，我设置的gate，第一张图 no gate，第二张图 G1=R1，第三张图：G3=R1 and R2 ,我的目的是先从APC阳性里选，然后FITC和PEcy5.5的双阳，最后再看PE的阳性，我这里明显错了，比如图3，R3里面的events居然比R2多，我的gate应该是设置错了，请各位老师指导下。
另外附个原始文件，有神马软件能离线补偿不？？
120619.rar (1.16 MB, 下载次数: 1)

2012-6-19 19:13 上传

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niwanmao

haven_t童鞋的cfcs软件就能够离线补偿调节啊
估计补偿的问题可能性大。不过我现在没有用笔记本上网，明天看看原始数据。

virginforest

niwanmao 发表于 2012-6-19 22:00

                               
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haven_t童鞋的cfcs软件就能够离线补偿调节啊
估计补偿的问题可能性大。不过我现在没有用笔记本上网，明天看 ...

  多谢倪老师 ，还有那个gate怎么设置哦

niwanmao

virginforest 发表于 2012-6-20 08:46

                               
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多谢倪老师 ，还有那个gate怎么设置哦

我看了之后，第一个感觉就是这细胞是不是都死掉了？或者处理的时候被弄碎了？
你在获取的时候各通道之间的补偿有调节吗？

virginforest

niwanmao 发表于 2012-6-20 09:00

                               
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我看了之后，第一个感觉就是这细胞是不是都死掉了？或者处理的时候被弄碎了？
你在获取的时候各通道之间 ...

死细胞应该很多，但是不会都是死的吧，补偿基本没调节，因为样本不够  就做了个空白，其他都是4染的。

virginforest

现在关键有个疑问，我的gate设置好像有问题 ，我想先gate  APC阳性，再从APC+里面 gate  PEcy5.5+ FITC+,最后是 APC+PEcy5.5+ FITC+里面找PE+，请教三张图的gate怎么设置，就是那个G1=R1，G2=R2。。。。。。那个怎么设置， gate的逻辑符号就是 and， or， not三种是吗？ 我怎么设置啊

niwanmao

virginforest 发表于 2012-6-20 12:58

                               
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现在关键有个疑问，我的gate设置好像有问题 ，我想先gate  APC阳性，再从APC+里面 gate  PEcy5.5+ FITC+,最 ...

先应该设置FSC/SSC点图的门，排除碎片。但我从你的数据文件FSC/SSC中总觉得这些细胞都是碎片，当时取完之后，镜下有没有观察过？
如果补偿没有调节，你设置阳性区域会有问题，可能是一些未补偿到位的荧光导致的阳性。如果因为细胞过少无法及时调节补偿，建议你可以使用平时检测时的补偿来代替。

virginforest

niwanmao 发表于 2012-6-20 14:16

                               
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先应该设置FSC/SSC点图的门，排除碎片。但我从你的数据文件FSC/SSC中总觉得这些细胞都是碎片，当时取完之 ...

镜下确实碎片多，多谢指点哈

niwanmao

virginforest 发表于 2012-6-20 14:32

                               
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镜下确实碎片多，多谢指点哈

呵呵。组织细胞最难做，因为消化成单个细胞悬液时特别容易受到伤害。
PROTOCOL区放了很多组织细胞制备单细胞悬液的方法，你选择一种比较适合的方法看看。

关于GATE，首先FSC/SSC设第一个R1，然后APC/SSC点图设R2，接下来PEcy5.5/ FITC点图设R3，最后PE直方图设MARKER，分析百分比。这时的GATE顺序依次为不设门、G1＝R1、G4＝R1 AND R2、G5＝R1 AND R2 AND R3

virginforest

niwanmao 发表于 2012-6-20 14:39

                               
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呵呵。组织细胞最难做，因为消化成单个细胞悬液时特别容易受到伤害。
PROTOCOL区放了很多组织细胞制备单 ...

多谢倪老师       另外请教下，为啥 第三、四张图就是G4和G5啦？ 不是顺序下来的G2和G3么？