流式细胞术检测凋亡的技术问题和常见问题解答

niwanmao

标题：流式细胞术检测凋亡的技术问题和常见问题解答

1.        附着细胞的凋亡研究：在悬液中的细胞比贴壁细胞更容易发生凋亡，建议在用胰蛋白酶处理前单独收集培养液中悬浮的细胞。
 
2.        固定剂的影响：在做DNA断裂片段分析凋亡细胞时（如APO-BRDU、APO-DIRECT），要注意使用化学固定剂（如多聚甲醛）固定细胞，使DNA交联。原因是：在洗细胞的步骤中，未固定的细胞可能会丢失小的DNA片段，而使用化学试剂固定后的细胞，小DNA片段就不会丢失。建议做DNA断裂片段分析细胞系时，比较不同的固定剂和破膜剂的效果。
 
3.        为了减少细胞丢失，染色、分析时建议使用12´75mm聚苯乙烯管。其它类型的试管（如聚丙烯管），会使细胞在管壁堆积，造成细胞丢失，并影响染色效果。洗细胞后，建议轻轻药匀细胞沉淀，避免使用加液枪，以免由于塑料枪头的使用造成细胞损失。
 
4.        洗细胞时应注意应洗到管壁内侧细胞可能附着的位置，使细胞充分悬浮。这样可以避免在随后的染色步骤中，由于细胞贴壁或悬着不充分，造成细胞染色不均一。如果细胞染色不均，在荧光参数分析时，表现为双峰现象，即多出一群着色弱的细胞。
 
5.        做APO-BRDU或APO-DIRECT分析时，若发现染色荧光弱，可以适当延长BrdU掺入反应的时间。一些细胞的反应时间可以到37°C 4小时。
 
6.        做APO-BRDU或APO-DIRECT分析时，可以结合PI染色，研究凋亡与细胞DNA周期的关系。