关于流式分选后细胞培养问题

dreamgirllong

倪老师，您好！我是用流式分选的细胞，然后培养。每次细胞在24小时后就死的差不多了。不知道要怎样才能提高细胞的活性。
我们的大致步骤是：
1、淋巴细胞分离液分离外周血的单个核细胞。
2、室温抗体孵育20min
3、上机flow rate 设置为1或2（怕快了对细胞损伤比较大，您的意见呢），每次分选的时间在30-60min（您觉得会不会太长）。之前鞘液都是用的生理盐水，工程师建议改用PBS，这个下次我们就改用这个。
4、在整个过程，我需要在间歇期把细胞至于冰上吗（包括孵育的时候），还是说室温比较好。
5、收集管我们是用胎牛血清200ul润管，然后直接收集，这个有影响吗？

niwanmao

这个问题我帮你转给 @gcz5340 版正来回答。
我因为没做过，没法给你具体的指导。不过我觉得流式分选之后大部分的人都是用来直接做后续的PCR或者其它生物学实验，很少再来培养。象你这种分选后继续培养的情况，我觉得磁珠分选更合适。

gcz5340

        首先我要纠正一下你的一个错误观念，flowrate改变并不会影响你的流速，只是细胞流的直径变宽，相对进样速率加快，所以这个加大的话不会损伤你的细胞，只会影响你图形的CV值和分选的纯度和得率，我们分选时一般控制4以下（Aria II机器，70 nozzle，87kHz的振荡频率）。

     鞘液的话我们一直用的是PBS，至于生理盐水有没有影响，我也不是很确定。分选时间1h以内应该说很短的，我们这边有人通宵分选的，细胞照样很好，你这个PBMC分选应该是分淋巴细胞，我觉得淋巴细胞还是很坚强的。样本的话一般情况下是要放冰上，接受管最好也放冰上。

    另外，流式分选细胞要经过高压、高速和高电荷的刺激，对细胞状态肯定是有影响的，但我们这边一般分选淋巴细胞活性还是蛮好的，不至于24h全都死光了。至于如何才能提高活性，这个话题就有点大了，我只能尽我所知提一些建议，你和你们分选技术人员商量讨论改进了：
1、不知道你们机器是什么型号，还有你们机器除了你，其他人分选的怎么样；
2、你的细胞分选后有没有污染呢，如果有污染细胞活性肯定不好，这就不是分选时的物理损伤了；
3、分选的时候接受管里面要加一点培养液或PBS缓冲一下，还要确定分选偏转的时候是不是掉落在液面上，如果是打在管壁上的话，几十米每秒的速度细胞肯定摔坏了；
4、实在想不出来了，你可以再提供一些细节（比如细胞种类、机器各种参数喷嘴大小、鞘液压力等），大家再讨论。

dreamgirllong

gcz5340 发表于 2012-8-26 12:17

                               
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首先我要纠正一下你的一个错误观念，flowrate改变并不会影响你的流速，只是细胞流的直径变宽，相对 ...

自从改了鞘液，和在收集管加入一定量的PBS收集，细胞的活性好了很多。还是感谢郭老师，在接下去的实验中可能还会遇到很多问题，希望还能像郭老师请教。

olivezhou0716

dreamgirllong 发表于 2012-9-2 15:35

                               
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自从改了鞘液，和在收集管加入一定量的PBS收集，细胞的活性好了很多。还是感谢郭老师，在接下去的实验中 ...

可以试试美天旎的磁珠分选，流式对细胞的伤害性相对是要大些，磁珠能改善很多