Live-dead kit去死细胞，你还在用PI、7AAD吗？

gcz5340

现在看很多文献上，做流式去除死细胞都是用Invitrogen公司的Live-dead kit，以前一直以为就是PI和7AAD的替代品，查了一下发现完全不同，远比PI和7AAD高级：
1、PI和7AAD发射谱很很宽，488laser发射基本上580BP和690BP都被占用了。Live-dead kit系列有多种，分别对应不同的激光器，发射出不同波长的光，而且发射谱很集中（说明书的图中有反应），这样大大减小了多色试验中的配色和调补偿的难度；
2、PI和7AAD的原理是染死细胞的核，Live-dead kit是染细胞表面或膜内侧的游离胺，活细胞弱阳，死细胞强阳。正是由于原理不同，所以对于一些需要固定破膜步骤的试验Live-dead kit一样适用，就算后面细胞都死了该kit还是能反应前面的死活情况，这点是核酸染料所不能替代的。

附上说明书，有使用过的战友欢迎出来谈谈用后感啊。

PDF附件见： Live-dead kit.pdf (281.83 KB, 下载次数: 128)

2012-8-30 23:11 上传

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niwanmao

郭版你用过吗？看介绍这个kit挺不错的，我以前也以为跟7-AAD差不多。

gcz5340

niwanmao 发表于 2012-8-31 08:46

                               
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郭版你用过吗？看介绍这个kit挺不错的，我以前也以为跟7-AAD差不多。

我也没用过，下次推荐别人试试。

universal627

不知道表面染色,细胞内/核内染色以及这个东西联用的时候 染色顺序怎么样?

gotofcm

universal627 发表于 2012-9-20 14:34

                               
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不知道表面染色,细胞内/核内染色以及这个东西联用的时候 染色顺序怎么样?

只要是在固定/破膜前染色就可以，在表面抗体前或后染色都可以的。

gotofcm

染色protocol:
Protocol: Fixable Viability Dye Cell Staining
Experimental Procedure
Allow vial of Fixable Viability Dye to equilibrate to room temperature before opening. Staining with Fixable Viability
Dye must be done in azide-free and serum/protein-free PBS. For consistent staining of cells, do not stain cells in
less than 0.5 mL.
1. Prepare cells as desired.
2. Wash cells 2 times in azide-free and serum/protein-free PBS.
3. Resuspend cells at 1-10x106/mL in azide-free and serum/protein-free PBS.
4. Add 1 μL of Fixable Viability Dye per 1 mL of cells and vortex immediately.
5. Incubate for 30 min at 2-8°C, protect from light.
6. Wash cells 1-2 times with flow staining buffer or equivalent.
7. Fix and/or permeabilize cells as desired.
Note: Cells may be stained with Fixable Viability Dyes before or after surface staining. After staining
with Fixable Viability Dyes, cells may also be cryopreserved for analysis at a later time. It is
recommended that each investigator determine the optimal concentration for the assay of interest.

niwanmao

gotofcm 发表于 2012-9-20 21:15

                               
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染色protocol:
Protocol: Fixable Viability Dye Cell Staining
Experimental Procedure

这个protocol是live/dead kit的protocol吗？似乎不是吧，是什么产品的？

gotofcm

niwanmao 发表于 2012-9-20 22:40

                               
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这个protocol是live/dead kit的protocol吗？似乎不是吧，是什么产品的？

这个是EB的protocol,和life的差不多，这类染料的原理是一样的：
2.1 Centrifuge a sample of tissue-culture cells in suspension. The sample should contain at least 1 × 10⁶ cells. Discard the supernatant.
2.2 Wash the cells once with PBS.
2.3 Resuspend the cells in 1.0 mL of PBS.
2.4 Count the cells and adjust the density with PBS to 1 × 10⁶ cells in a 1 mL volume in a microcentrifuge tube.
2.5 Add 1 μL of the reconstituted fluorescent reactive dye (from step 1.3) to 1 mL of the cell suspension and mix well.
2.6 Incubate at room temperature or on ice for 30 minutes.
2.7 Wash the cells once with 1 mL of PBS, and resuspend the cells in 900 μL of PBS.
2.8 Add 100 μL of 37% formaldehyde.
2.9 Incubate at room temperature for 15 minutes.
2.10 Wash once with 1 mL of PBS-BSA, and resuspend the cells in 1 mL of PBS-BSA.
2.11 Analyze the fixed cell suspension by flow cytometry. Both the green and red fluorescent dyes can be excited by the 488 nm line of an argon-ion laser. The blue fluorescent dye requires 350–360 nm UV excitation. The violet-fluorescent dye requires 405 nm excitation.
The emission should be detected in the appropriate channel: 530/30 for green, 585/42 for red, 440/40 for blue, and 440/40 for
violet (these may vary depending on the instrument).
Note: If fixation is not required, then steps 2.7–2.10 above can be skipped and replaced by washing the cells twice with 1 mL of
PBS-BSA, and resupending in 1 mL of PBS-BSA.

niwanmao

gotofcm 发表于 2012-9-21 11:08

                               
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这个是EB的protocol,和life的差不多，这类染料的原理是一样的：
2.1 Centrifuge a sample of tissue-cultu ...

试过几个EB的抗体，一直对它的印象不太好，呵呵。
不过foxP3的破膜剂还行。

gotofcm

niwanmao 发表于 2012-9-21 11:24

                               
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试过几个EB的抗体，一直对它的印象不太好，呵呵。
不过foxP3的破膜剂还行。 ...

呵呵，你都用过哪些呀？没听你说过有啥不好嘛。