人外周血Th17检测

63735523 · 发表于 2012-9-18 23:00:34

老师们好：

本人刚接触流式做Th17细胞，用人的外周血做，有个老师说可以不用刺激，直接检测的方法，不知道有没有？

niwanmao · 发表于 2012-9-19 08:58:22

需要刺激的，不刺激做不出来。刺激方案见http://www.flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=viewthread&tid=716

tree1004 · 发表于 2012-9-19 10:06:33

需要提取PBMC后计数培养刺激5-10个小时，然后流式染色才会比较容易检测出来。

63735523 · 发表于 2012-9-19 11:05:33

外周血5 ml提取 PBMC ，加入抗CD3 mAb ，抗 CD28 mAb（终浓度 1 g/ml），后放入 5%CO2 培养培养 24 时取2 X105
个PBMC加入抗 CD4-FITC ，室温避光孵育20 钟，破膜后加入 IL-17-PE抗体，再次室温避光孵育20 钟，1 500 r/min 离心5分钟，去上清沉淀用500ul PBS重悬，上机检测。
这种是我在一篇文章中找到的，可以么？老师

63735523 · 发表于 2012-9-19 11:13:41

中国免疫学杂志，<Th17 细胞在 Graves病中的变化及意义>

universal627 · 发表于 2012-9-19 11:18:21

cell stimulation
Culture CD4 T cells in 96-well flat bottom plate, 0.4 M cell per well, stimulate cells with 50 ng/ml PMA, 1 ug/ml Ion and Golgiplug for 5 hrs, then FACS staining.

63735523 · 发表于 2012-9-19 11:30:22

因为我们测的量比较大，要几百次，所以想问问倪老师上诉步骤可以么？我知道主流都是要刺激的，但是如果有不用刺激的也能得到承认的话那就少了很多工作量

niwanmao · 发表于 2012-9-19 14:42:04

63735523 发表于 2012-9-19 11:30

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因为我们测的量比较大，要几百次，所以想问问倪老师上诉步骤可以么？我知道主流都是要刺激的，但是如果有不 ...

怎么会先标抗体，然后再刺激？那抗体还能用？我有点奇怪，一般都是先刺激完，然后再标表面抗体，最后标胞内的细胞因子啊。

看看这篇文档Increased Number of Tc17 and Correlation with Th17 Cells in Patients with ITP ，这个methods会对你有帮助：http://www.flowcyto.cn/bbs/reade ... JfuRrpLKwxZPA3QAmb4

63735523 · 发表于 2012-9-19 15:14:49

倪老师，中国免疫学杂志那篇文章根本没有刺激，只是培养了24小时,就破膜了。是非常奇怪的做法，不知道靠谱不靠谱
你给的那篇文章给我帮助很大，谢谢老师。

haven_t · 发表于 2012-9-19 17:29:18

加入抗CD3 mAb ，抗 CD28 mAb就是刺激的其中一种方法，CD3和Anti-CD3结合，anti-CD28相当与CD80、CD86的作用，印象中好像叫是共刺激分子。注意加进去的抗CD3 mAb ，抗 CD28 mAb这两个抗体是没标记的，作用就是为了刺激，而CD4是FITC标记的，是用于检测。

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