关于临床血标本处理的若干问题

穿越地平线

倪老师和各位老师好，本人现在跑流式进入困境了，有以下几处疑问：
       我是用EDTA.K2的抗凝管从临床上采集的2ML的外周血，当然因为临床工作的关系，没有在4-6小时之内处理，基本上是在当天处理的。我是通过红细胞裂解的方法提取MNC然后用4%的福尔马林固定细胞，等搜集到一定程度一块跑流式。请问，倪老师这样跑流式会影响结果吗？就是先固定后跑流式，而且孵育抗体时时在冰上然后再放到4°冰库。

niwanmao

你是做什么标本？

一般我们做免疫分型标本都是放4度冰箱保存，48～72小时没有问题。
标本保存若干标准可参见: http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-982-1-1.html
和http://www.flowcyto.cn/bbs/reade ... McnEPCD73TPRIezakoc

穿越地平线

外周血EPC（内皮祖细胞）的含量采用CD34和KDR来标记细胞，倪老师

niwanmao

穿越地平线 发表于 2012-10-12 22:57

                               
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外周血EPC（内皮祖细胞）的含量采用CD34和KDR来标记细胞，倪老师

哦，这个不固定都是可以的，我印象中几年以前心血管科的研究生做过，这类稀有细胞我觉得提取pbmc可能会损失掉，是否可以考虑采取红细胞裂解？当然，提取可能使背景更干净。

穿越地平线

倪老师，我就是全血用红细胞裂解的方法用PBS洗2遍后就用福尔马林固定后放置在4°冰库，等搜集到一定数目的标本后一起大规模地跑流式，不固定怎么可以呢？不理解。不固定一是细胞数目会较少（EPC-MNC-WBC，而白细胞的寿命是6-8小时，我看文献血标本都是6个小时之内处理的，而我们因为平常临床上太忙了（我目前在上海华山脑外科）血一般不能在6个小时之内处理的，尽量都是当天处理的。二是不固定的话，细胞表面的抗原会不会变化？

穿越地平线

敬请指教！！！！！

niwanmao

穿越地平线 发表于 2012-10-13 14:45

                               
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倪老师，我就是全血用红细胞裂解的方法用PBS洗2遍后就用福尔马林固定后放置在4°冰库，等搜集到一定数目的 ...

首先，6－8小时指的是外周血终末期分叶核粒细胞的寿命，而你测的是EPC，这种细胞的寿命不是你想象的那样短。
其次，按照我们平时做免疫分型的经验，标本不固定放置1－2天，其抗原强度改变不大的。
最后，如果需要固定，建议用FICOLL提取PBMC之后，再用多聚甲醛固定，而不是福尔马林，因为福尔马林对表面抗原表达和细胞形态影响很大。

综上，由于你为了集中一批标本一起检测，所以我建议你平时收到标本之后，先用FICOLL液提取PBMC，然后用1％多聚甲醛固定，保存在4度冰箱，一个星期集中测一次。至于多聚甲醛固定的标本能保存多久，以前讨论过：http://www.flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=viewthread&tid=1134

穿越地平线

是的，倪老师，我就是用多聚甲醛固定的，4%的多聚甲醛我们一般俗称福尔马林，不是病理科说的那种10%的中性福尔马林溶液。用FICOLL提取PBMC和用红细胞裂解液的办法提取的细胞跑流式差别很大吗？

穿越地平线

倪老师，看看我的步骤有没有问题？
人外周血流式操作流程

1.在EDTA.K2抗凝管中抽取外周血1-2ml
2.加入1X红细胞裂解液10ml,混匀，室温孵育15分钟（参照说明书）
3.1000rpm离心5分钟
4.弃上清，混匀，加入3-5ml　PBS，1000rpm离心5分钟 *2次
5.加入4%PFA3-6ml(根据细胞计数调整加入量）重悬，置于4℃
6.从4°冷库取出样本，吹打混匀，取400ul至于EP管中，1500rpm离心5分钟
7.弃上清，加入300ulPBS重悬后加入流式抗体CD31并置于4°暗室孵育30min
8.1500rpm离心5分钟
9.弃上清，加入500ulPBS重悬后再次1500rpm离心5分钟
10.弃上清，加入400ulPBS重悬后至流式管中上机

穿越地平线

那次您说的那个体积的问题我知道了，想让您看看出了体积问题外还有没有别的问题。