CD133抗体的稀释

dancy20062008 · 发表于 2012-10-12 22:34:00

大家好，我准备用PE标记的CD133抗体做流式分选鼻咽癌CNE2，不知道这个抗体怎么稀释呢，要用到buffer和FcR，体系如下：

10的7次方的细胞数，80ul buffer液，20ul FcR Bloking Reagent液（这个准备用BSA代替），10ul的CD133/2抗体。想请问一下，我要准备的细胞总数是3×10的5次方，那我的稀释液都是同等比例稀释还是继续原体系啊，另外，这个buffer液可以用什么替代吗或者自己可以配制吗？

niwanmao · 发表于 2012-10-12 23:17:53

一般来说建议不变。不过你这点细胞可能分选不够吧 @gcz5340

dancy20062008 · 发表于 2012-10-14 09:27:06

niwanmao 发表于 2012-10-12 23:17

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一般来说建议不变。不过你这点细胞可能分选不够吧 @gcz5340

恩，谢谢倪老师，我先准备测试一下阳性表达率，再分选。老师的意思是要分选的话，尽量多些细胞是吧。另外分选出来的细胞可以扩大培养吗？

niwanmao · 发表于 2012-10-14 13:48:41

分选有一定的回收率的，所以细胞太少你取不到足够的目的细胞。建议10的7次方细胞。如果要继续培养，对管路和分选环境的消毒很重要

gcz5340 · 发表于 2012-10-15 12:23:34

准备多少细胞是由你分选群体的百分比和你要得到的细胞数目决定的，比如你要得到1X10^5的细胞，你CD133阳性只占1%，那你可能就要准备1X10^7每个样本，考虑到调试机器以及分选过程中的损失，最好有2-3X10^7个细胞，其他的情况依次类推。

dancy20062008 · 发表于 2012-10-16 09:08:34

嗯嗯，谢谢老师们啦，还想请问一下哦，这种直抗一般是什么时候加到细胞中去呢，是离心用培养液加进去之后计数，再加抗体吗；然后再离心，再用PBS洗2遍，这样做对不对啊

niwanmao · 发表于 2012-10-16 17:11:44

dancy20062008 发表于 2012-10-16 09:08:34

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嗯嗯，谢谢老师们啦，还想请问一下哦，这种直抗一般是什么时候加到细胞中去呢，是离心用培养液加进去之后计数，再加抗体吗；然后再离心，再用PBS洗2遍，这样做对不对啊

检测的话是需要把细胞的培养基洗涤干净，然后调整细胞密度，取100ul加抗体。不知道分选是否一样
@gcz5340

dancy20062008 · 发表于 2012-10-21 15:42:49

现在慢慢弄清楚一些了，步骤如下：消化离心后制成单细胞悬液，计数，调整细胞浓度1乘10的6次方-----PBS洗2次------加100ulPBS，加10ul抗体，充分混匀-------置冰上避光20min。我不知道这步标记抗体后，还需不需要再用PBS洗涤呢

niwanmao · 发表于 2012-10-21 16:15:09

dancy20062008 发表于 2012-10-21 15:42

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现在慢慢弄清楚一些了，步骤如下：消化离心后制成单细胞悬液，计数，调整细胞浓度1乘10的6次方-----PBS洗2 ...

加抗体之前是要把细胞悬液体积调整到100ul，而不是说加100ul PBS，因为前面的离心去上清之后，里面肯定会留有一点点PBS，所以这个时候加入的PBS要略少于100ul。

抗体孵育以后，需要再用PBS洗涤至少一次。

dancy20062008 · 发表于 2012-10-25 12:12:14

嗯，置冰上避光20min后，我用PBS洗涤了2次。去测试了阳性表达率才0. 7%，好少好少啊。还是准备试着去分选一次，看看怎么样

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