求流式检测脾脏组织的Th1/Th2/Th17/Treg的Protocol

chenmei

我最近要做流式检测小鼠脾脏的Th1/Th2/Th17/Treg，但我从杀小鼠取脾脏到上机检测都没接触过，不知道取脾脏脾脏过程中需不需要无菌操作，一只小鼠的脾脏用淋巴细胞分离液分离的话能分离出多少细胞呢，老师让我单独完成，我鸭梨特大，想请教各位大侠给点意见，当然了，有这个Protocol那就更好了

niwanmao

脾脏细胞的分离可参见  @laikete 站友的protocol中第二步 ：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-1907-1-1.html
后续的染色，可参见你订购的试剂说明书，说明书上一般写的非常详细。
至于分析，可参见流式细胞术检测Th22/Th17/Th1/Th2/Treg的应用  

vtea

如果你分离的脾单个核细胞不用于培养的话，一般不用无菌操作。一个小鼠的脾大概能取10^8个单个核细胞。
关于脾细胞悬液制备,我们实验室是这样做的：
1.小鼠拉颈处死，75%酒精过一下
2 剪开腹膜，在胃后找到长条状脾，镊子小心分离，放入含2ml的4℃预冷PBS的平皿，将脾置于用两块毛玻璃片中间，平行研磨（可重复几次），再用2mlPBS将玻片残留细胞冲到平皿，静置1-2min
3 吸取研磨液过220目滤网，离心（4℃，14000,5min），弃上清，加1-3ml红细胞裂解液重悬（根据脾红细胞多少可调整），RT, 5-10min。离心，同前
4 洗涤：加2ml预冷PBS重悬，离心同前，弃上清。（此步骤可省）
5 加适量PBS重悬，计数（做流式不可少的一步）。我一般加2ml重悬，再取一点稀释100倍后计数。
至于Th1/Th2/Th17/Treg检测，倪老师给的建议和URL已经很好了！

chenmei

对，很给力的步骤，谢谢vtea！
再有，请教一下，我后面是要做流式检测，毕竟大部分都是胞内甚至核内的指标，分离之后还必须得刺激分泌细胞因子，那么如果说我在取脾脏分离单个核细胞时不采取无菌操作，细胞数量会不会大打折扣呢；
还有，流式检测Th1/Th2/Th17/Treg时我本来是想一个样同时检测这四群细胞的，但考虑到染色时的整个液体体积比较大，不知道抗体会不会被变相稀释，那如果是分两个管检测的话，哪些细胞群和在一起检测结果会比较好呢，恳请诸位老师的指教~

niwanmao

chenmei 发表于 2012-12-05 10:48:43

                               
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对，很给力的步骤，谢谢vtea！
再有，请教一下，我后面是要做流式检测，毕竟大部分都是胞内甚至核内的指标

放到一管里面检测可能对机器和荧光搭配要求比较高，不过不会影响你的染色体积啊，你可以适当调节标本量的。

kingkeer

倪老师您好，我想请教一个问题：我想测人外周血里面的Th1/Th2/Th17/Treg，但是不想刺激测细胞因子。只用对应的转录因子测可不可以(包括以下抗体CD3,CD4,CD8,CD25,T-bet,GATA3,RORγt,Foxp3）？。还有就是这样测，做了两次发现除了Treg其他细胞比例太低，有时候很难说有还是没有，不知道是不是我的模板没建好。请问老师有什么好的建议吗？看到你的帖子“多色流式优化方案17：人CD4＋辅助T细胞和滤泡辅助细胞”，全用的是膜表面的标记（CCR4－ CCR6－ CCR10－ CXCR3＋ Th1），不知道这样测业内认可度怎么样？

niwanmao

kingkeer 发表于 2017-11-12 14:01
倪老师您好，我想请教一个问题：我想测人外周血里面的Th1/Th2/Th17/Treg，但是不想刺激测细胞因子。只用对 ...

有不少文献支持，具体你可以搜一下。
Th1/Th2/Th17的表面标记组合，目前有公司出了商品化组合。所以都是没有问题的。

summer-suk

kingkeer 发表于 2017-11-12 14:01
倪老师您好，我想请教一个问题：我想测人外周血里面的Th1/Th2/Th17/Treg，但是不想刺激测细胞因子。只用对 ...

求教您最后是怎么做的

Yuki飘

老师您好，请问如果提取的脾细胞不用于培养，要做Th1/Th2的测定，那么不做无菌操作，对加刺激剂和BFA后的孵育有影响吗？谢谢

18832287133

Yuki飘 发表于 2018-7-4 10:01
老师您好，请问如果提取的脾细胞不用于培养，要做Th1/Th2的测定，那么不做无菌操作，对加刺激剂和BFA后的孵 ...

没有影响，我们都是在外面取的，然后在细胞室刺激5个小时，再拿出来在外面进行敷抗体等步骤