求助小鼠脾淋巴细胞流式检测

六轮花开

我分离了小鼠的脾淋巴细胞，用CFSE染色后加药刺激增殖，我本打算在72h培养结束后进行CD25-PE和Foxp3-PE-Cy5的染色，这样流式检测的时候可以分别看CD25+Foxp3+和CD25-Foxp3-两群细胞的增殖情况，因为标记CD25和Foxp3的染料分别走2，3通道，与CFSE检测通道并不冲突。但是又想起来Foxp3的染色需要先破膜，那这样的话细胞内标记的CFSE会不会跑到胞外？我这个想法可行吗？如果进行Foxp3染色会影响CFSE的检测吗？多谢多谢~~

niwanmao

我没有做过，但是从相关资料看，是可以的，不会有这种问题的，参见：www.flowcyto.cn/bbs/thread-1969-1-1.html

需要注意的是cfse和pe之间的补偿调节

laikete

不会有问题的，我做过类似的实验

六轮花开

laikete 发表于 2012-12-11 17:56

                               
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不会有问题的，我做过类似的实验

恩好，多谢！那你的脾淋巴细胞是用什么刺激增殖的？培养了几天去测才有比较好看的分代峰呢？

laikete

六轮花开 发表于 2012-12-11 20:32

                               
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恩好，多谢！那你的脾淋巴细胞是用什么刺激增殖的？培养了几天去测才有比较好看的分代峰呢？ ...

我们用ConA刺激，也可以CD3/28刺激，一般是72小时左右增殖的峰最明显，你可以试试，有结果了和我交流下

六轮花开

laikete 发表于 2012-12-13 09:13

                               
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我们用ConA刺激，也可以CD3/28刺激，一般是72小时左右增殖的峰最明显，你可以试试，有结果了和我交流下 ...

我是用的APC刺激，另外加药。用ConA刺激的是阳性对照组，可能我的ConA放太久了，10ug/ml的浓度刺激3天还没怎么增殖。得买新的了

laikete

六轮花开 发表于 2012-12-13 09:48

                               
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我是用的APC刺激，另外加药。用ConA刺激的是阳性对照组，可能我的ConA放太久了，10ug/ml的浓度刺激3天还没 ...

ConA10ug还没刺激起来可能是ConA有问题了，我一般用的是2.5ug/ml，12小时后就能在镜下看到很明显的成团了

六轮花开

laikete 发表于 2012-12-13 11:02

                               
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ConA10ug还没刺激起来可能是ConA有问题了，我一般用的是2.5ug/ml，12小时后就能在镜下看到很明显的成团了 ...

恩。我看文献上一般用的浓度也很低的。应该就是得买新的了。

六轮花开

laikete 发表于 2012-12-13 11:02

                               
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ConA10ug还没刺激起来可能是ConA有问题了，我一般用的是2.5ug/ml，12小时后就能在镜下看到很明显的成团了 ...

不知道您当时做的实验是怎样的？我这次先分离了脾淋巴细胞，标记了CFSE，培养N天后染CD25和Foxp3，然后测流式。但是重复了两次都是CD25+Foxp3+这群细胞都很少，数据没法分析。应该是染色染的不好吧。我下一步想纯化出来CD4+T细胞后标记CFSE，培养几天后染CD25和Foxp3.。想看Treg和效应T的分别增殖情况，很怕像这次这样染色不好没法分析，不知道您当时做了和我类似的实验吗？染色怎么样？不知道我的问题到底出在哪里。是不是抗体用量太小了。可是之前用这个试剂盒染的都挺好的。谢谢！

laikete

六轮花开 发表于 2012-12-14 09:27

                               
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不知道您当时做的实验是怎样的？我这次先分离了脾淋巴细胞，标记了CFSE，培养N天后染CD25和Foxp3，然后测 ...

有一点需要确定的是：Treg在体外ConA处理下能增殖吗？