流式分选加的抗体量计算

zhouby701

请问下流式分选加抗体的量要如何计算呢？我买的是biolegend的抗体，比如我分选CD45（---)细胞，按照说明书10（6）次方细胞加0.25微克抗体，也就是约1.25微升。那么如果我分选的细胞总数是10（8）次方，我是应该加125微升抗体吗？还是分选的时候抗体的计算另有不同呢？有老师同学可以帮着解答一下吗？多谢了！

niwanmao

这个问题以前讨论过: http://www.flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=viewthread&tid=1755

我建议抗体用量可以增加几倍，并且注意体积保持原来的100微升。

laikete

细胞多流式分选时，我一般都是按平时抗体用量的1/3加，没有出过问题

zhouby701

niwanmao 发表于 2012-12-27 17:28

                               
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这个问题以前讨论过: http://www.flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=viewthread&tid=1755

我建议抗体用量可以 ...

非常感谢您的回复，我不明白的是您指的100微升体积大概里面有多少细胞呢，我的意思是您推荐的分选时的染色浓度是多少？比如我有1*10（8e）也就是一亿个细胞，我应该在多少体积的staining buffer中染色呢？我有同学说染色的浓度是2~3*10(8e)/ml,您觉得可以吗？

zhouby701

laikete 发表于 2013-1-22 14:56

                               
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细胞多流式分选时，我一般都是按平时抗体用量的1/3加，没有出过问题

谢谢您的回复，您指的平时抗体用量的1/3是指什么意思呢？不太明白。

niwanmao

zhouby701 发表于 2013-1-27 19:51

                               
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非常感谢您的回复，我不明白的是您指的100微升体积大概里面有多少细胞呢，我的意思是您推荐的分选时的染 ...

一般标准的产品说明书针对的都是1×10E6细胞，体积是100ul，所以对应的标本细胞密度是1×10E7/ml，所以如果你要做的细胞密度比标准高20－30倍，对于一些效价高的抗体，没有问题，但有些公司的抗体效价不高，可能就影响很大，所以做之前可以先打听一下该抗体的口碑如何！

zhouby701

niwanmao 发表于 2013-1-27 20:05

                               
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一般标准的产品说明书针对的都是1×10E6细胞，体积是100ul，所以对应的标本细胞密度是1×10E7/ml，所以如 ...

那我前两次染的时候细胞的密度是2×10E8/ml，抗体用的是体积换算1000:100，用的是10微升的biolegend抗体。你觉得怎么样呢？是不是我需要做个梯度实验，看看哪个浓度染出来效果最好呢？谢谢你的指导

niwanmao

zhouby701 发表于 2013-01-29 10:53:07

                               
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[quote]niwanmao 发表于 2013-1-27 20:05 [url=forum.php?mod=redirect&go

如果能够做浓度梯度滴定，那是最好的、最标准的做法

laikete

niwanmao 发表于 2013-1-29 11:15

                               
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如果能够做浓度梯度滴定，那是最好的、最标准的做法

倪老师说的对啊，最好是做滴定后再做啊，我们都是滴定后稀释了再做，特别是对于效价不高的

gcz5340

        关于抗体用量，一般来说抗体说明书上推荐量应该都是过量的，比如你说的10^6个细胞推荐1.25ul，很多时候会发现10^7个细胞加这么多抗体量也是够的。
        关于分选抗体用量我问过很多同学，一般都是这么处理的（以你的为例）：10^7个细胞100ul体系可以加1.25ul，10^8个细胞就1ml体系，10倍的抗体12.5ul，如果2X10^8，可以适当的稍微多加一点，也不一定要成比例的加倍。但是有一点，孵育的时候要隔几分钟混匀一次，防止细胞沉下来，抗原抗体结合不充分。
        这只是很多用户的一些经验，建议你第一次试验可以尽量多加点，如果后面发现没问题，可以稍微减一点。