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悬赏1流星已解决
最近正在学习流式细胞仪的使用,现在上手的是细胞周期的测定。关于周期的测定有一些体会,写在这里给大家分享一下吧。
1.关于细胞的离心
其实离心只要1500-2000r/min就可以了。原来不懂相对离心力和转速的换算,走了很多弯路。多谢倪老师的指点才让我茅塞顿开。最一开始做周期的时候,总感觉细胞在70%乙醇中固定的时候离心不下来,离心后有很多漂浮的白色物质。可是加大转速的话,又会导致有很多细胞碎片。经过一番系统的学习,才知道只要转速达到了,该离心下来的细胞都会下来的,那些白色的物质可能是断裂的DNA吧,不用管它就好。经常做周期的时候离心完都看不到细胞,然后只能抹黑抓瞎继续做,到了最后一样能检测到细胞的。
2.关于PI染色
因为PI不能穿过正常的细胞膜,所以在染色的时候,为了增加细胞的通透性,会加入表面活性剂TritonX-100,我们实验室一般会把PI配成10*的。刚开始我怕PI染不上,就没有按照比例稀释,结果导致染液中的Triton过大,上机几乎看不到完整的细胞了。全是碎片,随即拿到光镜下也看到的都是碎片。经过一番排查(每一步操作都观察形态),排除掉了乙醇固定和离心的问题,最终认为就是染液中的Triton浓度太大造成的,稀释浓度后问题就解决了。
顺便说一下,我们的PI和RNase是单独配制的,染色时,共同孵育。
3.关于结果分析
我个人觉得在流式细胞仪结果的分析中,认为的主观因素占有很大的比例,尤其是在周期中。通过不同的圈门方式,可以认为的把CV,RCS值降低,并且改变周期中的比例,我不知道这样做算不算是学术造假。反正我分析的时候尽量是按照自己想要的方向分析的,不知道老板知道了会不会发怒啊!嘿嘿
这几天在论坛里逛了好久,发现这里高手如云。对我一个刚接触流式的小白有很大的帮助。上面写的一点都是我一个菜鸟的“心得”。希望大侠们不要笑话我白痴哈。关于流式细胞仪测周期的实验,还有许多问题想向大家请教,希望大家能够多多交流,相互帮助。
最后衷心的感谢一下倪老师的帮助!谢谢
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这种经验型的帖子是我们最喜欢看到的,非常感谢@cccssszzz08 的分享,这个帖子相信可以让很多朋友少走很多弯路。
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