向PBS加入无水乙醇会产生白色絮状沉淀是为什么呢

zml

各位，想请教下，今天在做70%乙醇固定的时候，在向PBS中加入无水乙醇时，总是会产生白色的絮状物质，是什么原因呢？我是讲菌体混匀在300ul的PBS内，再缓慢加入700ul无水乙醇，分十次加的，每次加的时候都会震荡，是用的VOTEX的最小的频率震荡的，但是在加到约400ul的时候即会产生白色的絮状物质，这是之前都没有出现过的，实在是不太清楚是为什么。急求各位指教呀！！多谢呀·

niwanmao

出现白色絮状物我看到过，一般都是细胞死亡的表现，因为细胞死亡后，其内的DNA和胞内蛋白被乙醇固定后就呈白色絮状物，去掉之后，细胞就很少。
细菌我想应该也差不多吧。

zml

niwanmao 发表于 2013-1-7 21:12

                               
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出现白色絮状物我看到过，一般都是细胞死亡的表现，因为细胞死亡后，其内的DNA和胞内蛋白被乙醇固定后就呈 ...

去掉后基本就没有菌体离心出来了·我是取得对数期的菌体，应该是处于活性最强的呀·所以不是很明白，而且之前是同样的时间取出来的菌体，没有出现这种情况。不知道会不会有操作上的失误呢？我明天再换新的菌试试吧，谢谢老师了呀·

niwanmao

zml 发表于 2013-1-7 21:15

                               
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去掉后基本就没有菌体离心出来了·我是取得对数期的菌体，应该是处于活性最强的呀·所以不是很明白，而且 ...

可以肯定的是细菌基本死光了，但什么原因还是需要排查的：究竟是细菌的问题还是试剂的问题。

我的建议：
菌体离心后，把上清去光，不要加PBS，然后直接加1－2ml 70％的乙醇，边滴边振荡。

zml

niwanmao 发表于 2013-1-7 21:39

                               
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可以肯定的是细菌基本死光了，但什么原因还是需要排查的：究竟是细菌的问题还是试剂的问题。

我的建议： ...

好的，我明天试下再反馈结果，谢谢老师呀

blp

我也是将上清去光，仅剩10ul的PBS水膜，直接遍震荡边加入酒精，任然有少许絮状漂浮物，是DNA还是没有散开的细胞？

niwanmao

blp 发表于 2018-12-3 00:40
我也是将上清去光，仅剩10ul的PBS水膜，直接遍震荡边加入酒精，任然有少许絮状漂浮物，是DNA还是没有散开的 ...

絮状的话，基本上可以排除掉细胞，粘粘的絮状物，往往是DNA

blp

倪老师，谢谢你的回答，刚刚开始流式，收集网上额的资料特请教：
1、乙醇固定有两种方法：A、用少许PBS重悬细胞后，按体积比直接加无水乙醇，最后配成70%-80%乙醇浓度，冰箱过夜；B、收集细胞后吸取上清，震荡滴入70%-80%乙醇溶液，冰箱过夜，请问到底哪种方法是正确的？
2、网上有说乙醇一定用PBS配，有的说用DD水配？那个是正确的
3、我是用B法固定，感觉滴入跟直接加入没啥区别，最后还得吹打才能成单个细胞？
谢谢！

niwanmao

blp 发表于 2018-12-5 03:17
倪老师，谢谢你的回答，刚刚开始流式，收集网上额的资料特请教：
1、乙醇固定有两种方法：A、用少许PBS重悬 ...

用水配，用B方法

blp

谢谢倪老师，我就是按B法，出现少许絮状物。因为我的细胞数目少，收集一次不容易，所以担心细胞死亡后数目更少，影响结果，我准备再double一次，再去上机。