流式抗体设计

willow2013

各位老师好，我要检测间充质干细胞，用BD的流式细胞仪，选择了分别由FITC，PE和APC标记的抗体，文献说三种不同荧光标记的抗体可以放在一只管内检测，可以节省细胞，我想问一下，1、这三种荧光直标的抗体如何设计具体实验？如空白对照？同型对照？荧光补偿？2、如果三种抗体都加到一个管中，需要的细胞量是多少？3、直标抗体如何分装？能否冻存？谢谢

niwanmao

1、用空白管调节电压，然后用FITC单标管，调节FL2-FL1的补偿，用PE单标管，调节FL1-FL2补偿，调节补偿的时候，可以同时适当调节电压。
2、三种抗体同时加到一管，细胞量跟标准需求一样，即1×10E6，也可以低于这个数。
3、直标抗体跟间标抗体一样，不能冻存，保存在4度冰箱。不需要分装，一般效期都还可以的。

willow2013

niwanmao 发表于 2013-3-6 10:49

                               
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1、用空白管调节电压，然后用FITC单标管，调节FL2-FL1的补偿，用PE单标管，调节FL1-FL2补偿，调节补偿的时 ...

谢谢倪老师！
我买的抗体有的是100tests的，看有人说要分装，还在想几百微升要怎么分呢

niwanmao

willow2013 发表于 2013-3-6 10:59

                               
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谢谢倪老师！
我买的抗体有的是100tests的，看有人说要分装，还在想几百微升要怎么分呢 ...

一般大公司的抗体包装瓶上都会写有效期至××××年××月的。

willow2013

那这三种抗体加的时候有先后顺序吗？

niwanmao

willow2013 发表于 2013-3-6 11:05

                               
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那这三种抗体加的时候有先后顺序吗？

多数情况下，先后顺序没关系，但对于一些结合位点有冲突的，可能就有影响，但很少：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-2117-1-1.html

实验都是需要探索条件的，你说是吧

willow2013

niwanmao 发表于 2013-3-6 11:16

                               
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多数情况下，先后顺序没关系，但对于一些结合位点有冲突的，可能就有影响，但很少：http://www.flowcyto. ...

恩，是的，

willow2013

如果要用同型对照的话，有三种荧光标记的同型对照，直接放到一管内检测就可以了吗？

niwanmao

willow2013 发表于 2013-3-6 12:39

                               
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如果要用同型对照的话，有三种荧光标记的同型对照，直接放到一管内检测就可以了吗？ ...

空白管、FITC单标管、PE单标管，这三管就可以了，同型对照加到上述三管中（当然，后两管中相应荧光的同型不要加），也是可以不用加同型对照的。

willow2013

niwanmao 发表于 2013-3-6 12:45

                               
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空白管、FITC单标管、PE单标管，这三管就可以了，同型对照加到上述三管中（当然，后两管中相应荧光的同型 ...

倪老师您上次说过，同型对照也可以用，只是效果不如FCM对照好！如果有同型对照的话，就是三种不同荧光的同型对照一只管，三种荧光标记的抗体一只管，再加一个空白管就可以了吗？