求助双染做凋亡问题！

cccssszzz08

最近小弟打算做双染凋亡了。虽然看过相关的资料，文章。但是自己从没有做过，做之前还是来这里取取经比较好。
1.关于双染凋亡的实验，分组设置应该是至少分为五组吧，分别是空白对照在AV-PI-区域；PI单阳在PI+区域；AV单阳在AV+区域；诱导凋亡的阳性对照在AV+PI+的双阳区域。剩下的就是我的实验组。这样分有什么问题吗？
2.单阳的是为了调节荧光补偿的吧？具体怎么调节我也不是很清楚，站里的protocol只有实验前处理，我想学习一下调试仪器的相关操作可以到哪里学习呢？
3.做单标的细胞是加药处理后的还是正常对照组的呢？如果是正常对照组里面的细胞需要额外的刺激不？如果不刺激的话就是正常细胞，不应该会被AV着色，更不会有PI进入细胞内呀！
啰啰嗦嗦问了一堆，希望有朋友能为我答疑，小弟在此先谢过了！

niwanmao

如果要处理过的细胞凋亡明显，分群就足够清楚，就可以直接用这种标本一管染AV/PI调节所有补偿和电压，单阳性的对照也就不需要设置。

cccssszzz08

niwanmao 发表于 2013-03-15 09:53:10

                               
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如果要处理过的细胞凋亡明显，分群就足够清楚，就可以直接用这种标本一管染AV/PI调节所有补偿和电压，单阳

谢谢倪老师！我先做一次试试，有问题再请教！

cccssszzz08

niwanmao 发表于 2013-3-15 09:53

                               
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如果要处理过的细胞凋亡明显，分群就足够清楚，就可以直接用这种标本一管染AV/PI调节所有补偿和电压，单阳 ...

今天下午做了双染凋亡实验（碧云天的盒子，未减量）感觉自己失败了。结果图如下：

实验设计是打算验证一种纳米材料对H2O2诱导的氧化损伤有保护作用。想得到的结果是H2O2的加入使凋亡增多，而材料的加入又使凋亡减少。但是得到的结果却是这个样子的，左上象限的比例异常的多。不知是否是样品处理的问题还是AV没有染上。
我是否能够只用左下象限的比例增加来解释这种保护作用呢？
由于是在补文章的数据，时间紧张。而且不知下次试验结果是否能够令人满意，真的十分痛苦！
请倪老师帮忙看看，不胜感激。。。
附上原始数据 130318.zip (1.56 MB, 下载次数: 4)

2013-3-18 21:36 上传

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niwanmao

cccssszzz08 发表于 2013-3-18 21:43

                               
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今天下午做了双染凋亡实验（碧云天的盒子，未减量）感觉自己失败了。结果图如下：

实验设计是打算验证一 ...

能否说明一下各个数据的处理情况？感觉FL1-FL2减的多了点。另外，这个试剂盒AV分群是不清楚，不知道是确实质量问题还是你的细胞原因

cccssszzz08

niwanmao 发表于 2013-3-18 22:20

                               
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能否说明一下各个数据的处理情况？感觉FL1-FL2减的多了点。另外，这个试剂盒AV分群是不清楚，不知道是确 ...

您说的FL1-FL2减的多了点是指哪个地方呢？
001是control组 002是H2O2刺激组 3-6是预先孵育了24h的纳米材料然后又加了H2O2刺激，浓度依次增大！
细胞数减少是因为圈门的原因吧，细胞摄取了材料以后SSC会增大，同一个门圈的细胞会不一样的。

niwanmao

cccssszzz08 发表于 2013-3-18 22:26

                               
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您说的FL1-FL2减的多了点是指哪个地方呢？
001是control组 002是H2O2刺激组 3-6是预先孵育了24h的纳米材料 ...

是贴壁细胞吗？

niwanmao

cccssszzz08 发表于 2013-3-18 22:26

                               
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您说的FL1-FL2减的多了点是指哪个地方呢？
001是control组 002是H2O2刺激组 3-6是预先孵育了24h的纳米材料 ...

有点奇怪的是，001为什么AV-PI染的还不如其它几管呢

cccssszzz08

niwanmao 发表于 2013-3-18 22:34

                               
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是贴壁细胞吗？

是的，是不是有可能是消化细胞时造成的细胞破碎呢？可是从FSC-SSC看的话，细胞还是有形态的呀！

cccssszzz08

niwanmao 发表于 2013-3-18 22:36

                               
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有点奇怪的是，001为什么AV-PI染的还不如其它几管呢

嗯。。。头疼！
我记得您好像说过做双染凋亡的时候贴壁细胞消化用的胰酶要不加EDTA的，为什么呢？