CFSE增殖问题

vtea · 发表于 2013-4-21 23:14:52

最近做CFSE染色看鼠B细胞在体外不同刺激下的增殖情况，其中遇到一些问题，希望论坛的老师们解答。分析时需要染PI去除死细胞吗？还要染B cell marker会不会影响最后分析？我们实验室用PI是在流式管上机分析前立刻加1ul，不知这样是否合理，是会假阳性还是假阴性还是没有大的影响？另外，顺便再问下B cell体外增殖是不是有什么注意事项，我按照文献的刺激方式进行，出来的效果特别差，而且PI阳性特别多。
谢谢大家啦！

niwanmao · 发表于 2013-4-22 12:53:02

我只获取过数据，但未处理过标本，参考相关资料，我谈一点自己的看法，请有实战经验的站友一起来讨论一下。

1、上机前立刻加1ul PI的方式去除死细胞，似乎在哪里听说过，但其实通过FSC/SSC也基本上能去除大多数死细胞，PI可以不染就尽量不染，因为CFSE和PI之间的补偿非常难调。如确实要做，建议参考：http://www.flowcyto.cn/bbs/reade ... ZNVGd9C7jrsIjMAYVxs 的27－28页，将FL1－FL2定在60％以内，然后再通过调高或调低FL1电压，使细胞群能够正确分布。

2、非细胞株的细胞，不管是人的还是小鼠体外培养都存在较大的困难，再加上CFSE毒性较大，浓度过大，细胞就容易死，需要不断摸索其最合适的浓度。建议你做个CFSE浓度梯度看看之间的差别。

vtea · 发表于 2013-4-23 22:24:32

niwanmao 发表于 2013-4-22 12:53

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我只获取过数据，但未处理过标本，参考相关资料，我谈一点自己的看法，请有实战经验的站友一起来讨论一下。 ...

谢谢倪老师，回复晚了。我们用BD calibur ，PI用三通道也可以的。不断摸索中前进吧……

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