请教kappa/limbda的染色问题

sdjjcw

初来乍到，流式刚入手，用外周血摸了一下荧光补偿条件，发现B细胞的kappa/limbda怎么也没法分两群，正常人B细胞中应该是限制性表达这两种抗原吧！应该有两群细胞啊，我只能做出KAPPA/limbda双阳性和双阴性的细胞！请教了BD技术支持，听说血浆中含有很多kappa/limbda片段，会影响B细胞表面抗原 与抗体的结合，让我把血用PBS或者生理盐水洗4-5次后溶血，再结合抗体，昨天折腾到好晚，也没做出来。。。请问群中哪位大侠赐教~不胜感激！

niwanmao

洗涤非常重要，3次以上，洗到看不到黄色的血浆。
但另外还有一个很重要的因素，就是lambda和kappa的克隆，如果你用BD的做不出来，建议可以改用dako的，还不错。

sdjjcw

niwanmao 发表于 2013-5-8 11:37

                               
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洗涤非常重要，3次以上，洗到看不到黄色的血浆。
但另外还有一个很重要的因素，就是lambda和kappa的克隆， ...

直接洗血？我昨天也这样试了一下，100ul抗凝血+2ML生理盐水洗了五次。然后结合抗体，加溶血素，在洗涤一次上机检测，最后还是不成功，只有双阳性和双阴性的细胞，而且中性粒细胞和单核细胞都没多少了，难道这样会损失这些细胞吗？还有个问题，洗的时候转速用的1500rpm，弃上清的时候，管底还是少量有红色的液体（应该是红细胞吧）倒出来，这个该怎么办呢？
另外其他医院用BD的抗体做出来的~

niwanmao

sdjjcw 发表于 2013-5-8 12:53

                               
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直接洗血？我昨天也这样试了一下，100ul抗凝血+2ML生理盐水洗了五次。然后结合抗体，加溶血素，在洗涤一 ...

你用100ul太少了，你可以用0.5ml＋5mlPBS啊，只要达到10倍左右，洗3次就差不多了。
弃上清别用倒的方法，用吸管轻轻地吸，管底的红色物质大部分是红细胞，但由于目标细胞也混在一起，所以尽可能别去动它，可以留一点上清，问题不大的。

你可以多试几次，我不是说BD的做不出来，而是说如果你BD始终做不出来，可以换DAKO试试，因为有时候抗体的批次不同也会影响到抗体质量

sdjjcw

niwanmao 发表于 2013-5-8 13:53

                               
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你用100ul太少了，你可以用0.5ml＋5mlPBS啊，只要达到10倍左右，洗3次就差不多了。
弃上清别用倒的方法， ...

那洗完之后是先加溶血素还是先结合抗体呢？

niwanmao

sdjjcw 发表于 2013-5-8 14:17

                               
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那洗完之后是先加溶血素还是先结合抗体呢？

洗完之后，去上清，然后加适量PBS（依细胞多少而定）重悬，最后在流式管中加入抗体，再加入100ul标本孵育，孵育完毕后，裂解红细胞、离心、上机。

sdjjcw

niwanmao 发表于 2013-5-8 14:23

                               
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洗完之后，去上清，然后加适量PBS（依细胞多少而定）重悬，最后在流式管中加入抗体，再加入100ul标本孵育 ...

明天有血我再来试一下，感谢斑竹~

kobe327292007

sdjjcw 发表于 2013-5-8 15:09

                               
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明天有血我再来试一下，感谢斑竹~

为什么不用淋巴细胞分离液试试呢？

niwanmao

kobe327292007 发表于 2013-5-12 17:56

                               
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为什么不用淋巴细胞分离液试试呢？

在临床标本处理上，PBMC提取以前也有过，但后来大家基本上的意见是担心标本中一些稀有的细胞丢失或在分离过程中被破坏，同时也为了减少时间，所以就统一采取红细胞裂解方法。
但结果是差不多的，PBMC中多次洗涤＝此处的多次洗涤。

sdjjcw

niwanmao 发表于 2013-5-12 21:00

                               
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在临床标本处理上，PBMC提取以前也有过，但后来大家基本上的意见是担心标本中一些稀有的细胞丢失或在分离 ...

同意斑竹的看法，很多不建议先提取淋巴细胞。还有这几天做下来的结果发现BD的溶血素对于KAPPA/LAMBDA的染色效果不好，我用某医院自己配置的溶血素（他们也是用BD的溶血素发现分群不理想），kappa/lambda做出来了。交流一下步骤，50μl血加2ml溶血素后离心，用PBS or NACL洗三次后结合抗体，上机检测。