DeadEnd(TM)TUNEL试剂盒使用说明书（中文）

niwanmao

标题：DeadEnd(TM) Colorimetric TUNEL试剂盒使用说明书（中文）

本手册由丁香园wenbo85战友于2008年7月20日发表于丁香园论坛。

TUNEL说明书

1 介绍

 

TUNEL是提供单细胞水平细胞凋亡的稳定系统，能够迅速、快捷、精确的检测出凋亡细胞。该试剂盒可以通过测定核DNA片段检测组织切片和培养细胞的凋亡细胞。

多数高等真核生物的细胞都通过启动自身的细胞自杀程序实现程序性死亡或细胞凋亡。凋亡在发育、内环境稳定和一些疾病中具有重要作用。凋亡具有某些特定的形态学特征，包括细胞膜起泡，细胞核和细胞质固缩，染色质浓缩，并且不发生局部炎症反应。细胞死亡与此相反，它的特点是细胞肿胀，染色质絮凝，细胞膜完整性破坏，细胞溶解和产生及局部炎症反应。

凋亡过程中，内源性Ca2+、Mg2+依赖性核酸内切酶被激活，DNA被降解而形成末端为3’－OH、含180～200碱基对的不同倍数的核苷酸片段。TUNEL可用于多种细胞凋亡的检测，已经经过验证的应用范围: Vibratome® 神经组织切片, Jurkat 细胞, HL-60细胞

这本技术小册子包括检测组织切片和茴香霉素诱导的HL-60细胞的细胞凋亡。

检测原理: DeadEnd™ Colorimetric TUNEL 系统使用改良的TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)对凋亡细胞的断裂DNA进行末端标记。使用末端脱氧核苷转移酶(TdT)将生物素标记的核苷被掺入到DNA的3′-OH末端。然后，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(Streptavidin HRP)结合在上述生物素标记的核苷上，可以通过过氧化物酶的底物——过氧化氢和稳定的显色剂氨基联苯胺(DAB)检测到。用这种程序，凋亡细胞的核被染成深棕色。

 

2 产品内容

 

G7361

平衡缓冲液（G327B）——4.8ml

末端脱氧核苷酰酶酸转移酶（M828B）——20ul

抗生物素蛋白链菌素辣根过氧化物酶（G714A）——40ul

生物素化的核苷混合物（G715A）——20ul

蛋白酶K（V302A）——10mg

 

G7362

塑料盖玻片（G326B）——20

20X SSC（G329B）——20ml

DAB 20X 色原体（G716A）——200ul

20X DAB底物缓冲液（G717A）——200ul

20X过氧化氢（G718A）——200ul

 

储存条件: 将平衡缓冲液, TdT酶, 生物素标记的核苷混合物和蛋白酶K 储存于–20°C。将链亲和素HRP, DAB 20X Chromogen, 20X DAB底物缓冲液和20X过氧化氢储存于 4°C。20X SSC和塑料盖玻片室温保存。

★    ★★注意不同的成分保存条件不同！

 

在用蛋白酶K之前，将蛋白酶K重组到1ml的蛋白酶K缓冲液中（见第五部分），保存10mg/ml的蛋白酶K溶液于-20度，酶的稳定性渴持续至少六个月。

 

安全说明：平衡缓冲液含有二甲胂酸钾，避免眼睛和皮肤接触，请戴上手套和防护眼镜。DAB是可疑的致癌物，请戴上手套和防护眼镜。

 

3 试剂盒程序

3.1 概述

（1）使用者需提供试剂：

PBS 磷酸盐缓冲盐水

0.3\%过氧化氢溶液抑制内源性过氧化氢酶

固定液（例如：10\%缓冲的福尔马林，4\%多聚甲醛，4\%无甲醇甲醛）

封固剂

 

★    ★★ 注意不要用20X过氧化氢制备0.3\%过氧化氢溶液，用来抑制内源性过氧化氢酶。

 

（2）石蜡包埋切片的辅助试剂

﹡二甲苯或二甲苯替代物

﹡去离子水稀释的乙醇（100\%，95\%，85\%，70\%，50\%）

﹡0.85\%氯化钠溶液

﹡蛋白酶K 缓冲液

﹡DNase I(胰脱氧核糖核酸酶I)

﹡胰脱氧核糖核酸酶缓冲液

 

（3）组织切片的辅助设备

﹡多聚赖氨酸覆盖或硅烷化的显微切片

﹡coplin jars（coplin器，选择性DNase I阳性对照切片需要单独的的coplin器）

﹡镊子

﹡湿盒

﹡37度保温箱

﹡微量移液器

﹡盖玻片

﹡干净的指甲膏或胶布

﹡显微镜

 

3.2步骤

（1） 将石蜡组织切片置于染色缸中，室温下新鲜二甲苯浸洗2次，每次5min；

（2）染色缸中，室温下100\%的乙醇浸洗5min；

（3）100\%的乙醇重复浸洗3min，室温下依次用95\%、85\%、70\%和50\%的乙醇各浸洗一次，每次3min；

（4）室温下置于0.85\%氯化钠溶液浸洗5min；

（5）室温下置于PBS中浸洗5min；

（6）室温下置于4\%多聚甲醛溶液或含10\%福尔马林的PBS溶液中固定15 min；

（7）PBS浸洗二次，每次5 min；

（8）将载玻片取出置于一水平表面，用滤纸小心吸去载玻片上的多余液体，滴加100μL新配制的蛋白酶K工作溶液（在PBS中以1：500稀释10mg/ml蛋白酶K原溶液，得到20ug/ml蛋白酶K溶液）覆盖在样本区域上，室温下放置10～30min；

★    ★注意：蛋白酶K可以帮助渗透组织，但延长孵育时间可能导致切片脱落（come off the slide）,所以要最优化孵育时间长短。较薄的组织切片孵育时间要短，如5-10um石蜡切片，较厚的要长些。

（9）室温下染色缸内PBS浸洗5min；

（10）再置于4\%多聚甲醛溶液或含10\%福尔马林的PBS溶液中固定5 min；

（11）用PBS浸洗二次，每次5min；

★注意：如果需要（11），准备用Dnase I导致DNA断裂的阳性对照，步骤见3.4

（12）上述处理好的组织切片，用滤纸小心吸去载玻片上的多余液体，滴加100μL的Equilibration Buffer（平衡缓冲液）于样本区域上，室温平衡5～10min；

（13）载玻片平衡时，将生物素化的核苷混合物置冰上解冻，同时配制足够的TdT酶反应液（配置过程详见下表），于冰上保存待用；每个切片100ul反应液足以覆盖样本区域。

 

缓冲液成分	每标准100ul反应的成分体积	反应次数（实验反应+选择性阳性对照）	成分的体积
平衡缓冲液	98ul	×	=
生物素化的核苷混合物	1ul	×	=
rTdT酶	1ul	×	=

阴性对照

（14）用滤纸小心吸去样本区域周围的多余液体，滴加100μL的TdT酶反应液于样本区域上，不要让样本干燥；

（15）在反应区域盖上塑料盖玻片以确保反应液分布均匀，于37℃、湿盒中孵育60min，使末端标记反应发生；

（16）用去离子水1：10稀释20X SSC。去除盖玻片，将玻片放入20X SSC溶液的染色缸中终止反应，室温放置15min；

★注意：保证20X SSC的所有盐类在稀释前溶解
（17）室温下PBS浸洗三次，每次5min，移去未结合的生物素化核苷；

（18）在0.3\%过氧化氢的PBS中浸洗3-5min，抑制内源性过氧化氢酶；

★注意：不要用20X过氧化氢制备0.3\%过氧化氢溶液，用来抑制内源性过氧化氢酶

（19）然后PBS浸洗三次，每次5min；

（20）PBS1：500稀释抗生物素蛋白链菌素辣根过氧化物酶溶液，滴加100μL的于样本区域上，室温反应30min；

（21）然后PBS浸洗三次，每次5min；

（22）在用之前混合DAB成分。在950ul去离子水中加入50ul 20X DAB底物缓冲液，然后加入50ul DAB 20X 色原体和50ul 20X过氧化氢，于载玻片的样本区域滴加100μL DAB工作液，直到呈现浅棕色背景；（一般来说需要大约十分钟，但这个时间仍需优化），不要让背景变得太深。

★注意：保持DAB避光，时间控制在30min内

（23）去离子水漂洗若干次
(24)用水或永久的封片剂封片，水封片剂周围用指甲膏封住，显微镜下观察染色。

 

3.4 Dnase阳性对照步骤（可选择的）

在每个实验中，都可以设DNA断裂的阳性对照

Dnase 处理固定的细胞，导致DNA断裂，3＇-OH DNA末端暴露。生物素化的核苷酸结合在一起。以下的步骤一般使得处理的细胞过氧化物酶标记。

★    注意：阳性对照用单独的染缸，否则残余的Dnase使得背景加深

（1）    固定的细胞加100ulDNase缓冲液，室温孵育5min

（2）    倒出液体，加入100ul含有5-10单位/ml的DNase缓冲液，室温孵育10min

（3）    拍切片，去掉多余的液体，在盛有去离子水的染缸中漂洗3-4次，用于阳性对照

（4）    室温下在PBS中浸洗5min

（5）    用单独的染缸，按3.2步骤12-24处理阳性对照。

 

4 故障排除

故障	原因	处理方法
背景太深（例如非凋亡细胞强染色）	生物素化的核苷酸非特异性结合	1.在3.2第17步中可以用含有0.1\%Tritonx-100和5mg/mlBSA的PBS漂洗切片，接着单纯PBS漂洗一次去除非特意背景 2.在组织准备过程中，DNA开始降解，所以保证组织被迅速固定
全部背景太深	DAB孵育时间过长 没有抑制内源性过氧化物酶	缩短DAB孵育时间 增加0.3\%过氧化氢酶抑制时间
染色太浅	Tritonx-100或蛋白酶K渗透不够	调整渗透剂孵育时间
切片上组织丢失	组织切片被酶消化	减少蛋白酶K孵育时间