流式检测感染病毒细胞的亚群,

abc李莉

     由于病毒是存在于细胞浆内，因此使用了固定剂和透膜剂（Biolegend)
     首先进行细胞的表面分型进行相关抗体染色（流式检测没有问题），然后细胞标记的抗体染色完毕后再进行细胞内的病毒进行染色，包括先固定20min，然后用PBS 洗一遍，再用透膜剂再洗一遍，然后加入针对病毒的单抗，染色20min，然后用PBS洗两遍。上流式进行检测。
     流式结果发现，对照组和实验组细胞均有峰。
     请教各位我的问题问题出在哪里了，是单抗的非特异性染色？还是透膜过程（时间等）操作错了？还是我的染色步骤错了？
   

niwanmao

"加入针对病毒的单抗，染色20min"这一步有没有加入破膜剂？
另外，这种病毒位于胞内，固定后细胞膜孔可能会增大，一方面有利于抗体进入，另一方面会不会也导致病毒逃出细胞？

abc李莉

niwanmao 发表于 2013-8-29 18:02

                               
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"加入针对病毒的单抗，染色20min"这一步有没有加入破膜剂？
另外，这种病毒位于胞内，固定后细胞膜孔可能会 ...

用透膜剂稀释的直标单抗。

niwanmao

abc李莉 发表于 2013-8-29 22:23

                               
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用透膜剂稀释的直标单抗。

用破膜剂稀释？怎么稀释？

不是应该用破膜剂洗涤之后，去掉上清，留下一点破膜剂，直接加入单抗孵育吗

abc李莉

niwanmao 发表于 2013-8-29 22:47

                               
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用破膜剂稀释？怎么稀释？

不是应该用破膜剂洗涤之后，去掉上清，留下一点破膜剂，直接加入单抗孵育吗

对，我就是这么操作的，但是我没有考虑病毒会不会从打的孔里逃出来啊，有这个可能吗？文献报道的也是采用这种方法进行流式检测的呀。

niwanmao

abc李莉 发表于 2013-8-29 23:06

                               
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对，我就是这么操作的，但是我没有考虑病毒会不会从打的孔里逃出来啊，有这个可能吗？文献报道的也是采用 ...

病毒逃逸只是我个人的想法，可能不会。到别的地方借点其它品牌的破膜剂再试试。可以试试Beckman 免洗的Perfix nc

mybiosciences

这个阳性峰有可能是死细胞造成的

mybiosciences

另外，FSC/SSC圈门比较大，细胞群不一样，本地也是不一样的，阳性峰有可能是靠右上的细胞群